Elucidating the role of SOX11 in mantle cell Iymphoma

Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive lymphoid neoplasm derived from mature B cells genetically characterized by the presence of the t(11;14)(q13;q32) translocation causing cyclin D1 overexpression and therefore cell cycle deregulation. However, other additional secondary genetic alterations also contribute to MCL pathogenesis. Recent studies identified a distinct subgroup of tumors with an indolent clinical behavior even without chemotherapy that tend to present with non-nodal, leukemic disease instead of extensive nodal infiltration. Moreover, recent molecular studies have identified SRY (Sex determining region-Y)-like HMG box-11 (SOX11) as one of the best characterized discriminatory genes between these two clinical subtypes of MCL, being almost exclusively overexpressed in the aggressive presentation of the disease. SOX11 is a high mobility group (HMG) transcription factor (TF) characterized by its critical involvement in embryonic development and neuronal cell differentiation. Although not apparently expressed in any normal cell subtype of the lymphoid system, it has been recently identified as playing a major role in several solid tumors and some subtypes of aggressive lymphomas. However, SOX11 oncogenic mechanisms contributing to the development and progression of these diseases are largely unknown. Although SOX11 function and potential target genes in lymphoid cells are poorly known, its high specific expression in aggressive MCL suggests that it may be an important element in the development and progression of this disease. Two publications resulted from our studies and compose this thesis. In paper I, we initiated the molecular characterization and elucidation of the SOX11-regulated transcriptional program in MCL. We performed an integrative analysis coupling data from human genome-wide promoter analysis by SOX11 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)-chip experiments and gene expression profiling (GEP) upon SOX11 silencing in MCL cell lines, and identified target genes and transcriptional programs regulated by SOX11 including the block of mature B cell differentiation, modulation of cell cycle, apoptosis, and stem cell development. Paired box protein 5 (PAX5) stood out as one of SOX11 major direct target genes. We found that SOX11 silencing downregulated PAX5, induced B lymphocyte induced maturation protein 1 (BLIMP1) expression, and promoted the shift from a mature B cell into the initial plasmacytic differentiation phenotype in both MCL primary tumor cells and an in vitro model. We also demonstrated the oncogenic implication of SOX11 expression in the aggressive behavior of MCL as SOX11-knockdown derived tumors displayed a significant reduction on tumor growth compared to SOX11-positive tumors in subcutaneous MCL xenografts. Although our results suggested that SOX11 contributed to tumor development by altering the terminal B cell differentiation program of MCL cells, the specific SOX11-regulated mechanisms promoting the oncogenic and rapid tumor growth of aggressive MCL still remained to be elucidated. Therefore, in paper II, we further characterized the potential SOX11-regulated oncogenic mechanisms by integrating our ChIP-chip data with further analyses including GEP derived from the xenograft SOX11-positive and silenced tumors. Gene ontology analysis of SOX11 target genes and gene set enrichment analyses (GSEA) of the differentially expressed genes in xenografts, human primary tumors and MCL cell lines revealed that blood vessel development and angiogenic gene signatures were significantly enriched in SOX11-positive cells. Consequently, we performed in vitro angiogenic assays and observed that conditioned media derived from SOX11-positive cells induced higher tube formation, proliferation and migration of endothelial cells, corroborated by a prominent higher density of microvessels in human primary tumors and mouse xenografts. Strikingly, gene and protein expression profiling revealed that SOX11-modulation of angiogenesis in MCL was mediated by the upregulation of the pro-angiogencic factor Platelet-derived growth factor-A (PDGFA). Inhibition of the PDGFA pathway impaired angiogenesis development both in vitro and in vivo, and also MCL tumor growth in vivo, representing a promising novel therapeutic strategy for the treatment of aggressive MCL. Overall, we have unraveled and characterized, for the first time, the oncogenic role of SOX11 and the tumorigenic pathways it orchestrates in MCL. Importantly, the elucidation of molecular oncogenic mechanisms that are deregulated by SOX11 in MCL will aid the management and stratification of MCL patients and lead to the development of new therapeutic strategies for this aggressive disease.

Les neoplàsies limfoides són un grup heterogeni de tumors caracteritzats per un event genètic inicial i l’acumulació d’alteracions moleculars secundàries que condicionen la progressió tumoral. Els mecanismes genètics que condueixen a alteracions genètiques primàries són principalment les translocacions cromosòmiques que, generalment, resulten en l’activació d’un proto-oncogen que comporta l’alteració de la proliferació, l’apoptosi o la via de diferenciació de les cèl·lules B. El limfoma de cèl·lules del mantell (LCM) és una neoplàsia limfoide caracteritzada per una proliferació alta de limfòcits B madurs, i és considerada un dels limfomes no Hodgkin (LNH) més agressius amb una supervivència mitjana de 3-4 anys. L’evolució clínica acostuma a ser molt agressiva amb poca resposta al tractament i freqüent recidiva; són pocs els pacients que es curen amb les teràpies actuals. Tot i així, observacions clíniques recents han identificat alguns LCM amb un curs clínic indolent de la malaltia i una llarga supervivència dels pacients, inclòs sense la necessitat de tractament. Estudis d’expressió gènica diferencial han identificat que SOX11, un factor de transcripció neuronal, és un dels gens més ben caracteritzats per diferenciar els subtipus de LCM agressius i indolents ja que se sobre-expressa en els LCM agressius però no en els indolents. SOX11 pertany a la família dels gens SOX que codifiquen per possibles reguladors transcripcionals que desenvolupen funcions importants en diferents processos del desenvolupament. La funció de SOX11 i molts altres membres de la superfamília de proteïnes SOX actualment no es coneix, tot i que es creu que la funció de les proteïnes SOX és, almenys, en part estructural permetent que altres factors de transcripció s’uneixin al solc format a l’ADN i/o reunint elements reguladors, el que facilita la formació de complexes proteics. SOX11 se sobre-expressa constantment en gairebé tots els tumors de LCM agressius, a nivells inferiors en un subgrup de limfomes de Burkitt i limfoblàstics, però no en altres neoplàsies limfoides, en cèl·lules limfoides normals ni en pacients de LCM que segueixen una llarga evolució clínica indolent. Per tant, SOX11 ha estat identificat com a biomarcador en els tumors de LCM i possible factor pronòstic. Tot i que la funció de SOX11 i els seus possibles gens diana en cèl·lules limfoides es desconeixen, la seva alta expressió en els LCM agressius suggereix que SOX11 pot ser un element important en el desenvolupament i progressió d’aquest tumor. Per tant, els objectius d’aquest projecte de tesi doctoral són identificar, caracteritzar i validar les possibles vies oncogèniques regulades per SOX11 per obtenir un millor i major coneixement de la patogènesi del LCM, i trobar possibles candidats per a teràpies específiques per aquest tumor. Per realitzar aquests objectius hem estudiat els gens directament regulats per SOX11 mitjançant immunoprecipitació de cromatina,així com el fenotip associat a la pèrdua de l’expressió de SOX11 en línies cel·lulars de LCM establement transduïdes (model in vitro). A més a més, també hem estudiat l’habilitat tumorigènica de SOX11 mitjançant el xenotransplantament subcutani de les línies cel·lulars generades in vitro en ratolins immunodeficients (SCID) (model in vivo). Un cop hem identificat els possibles gens diana i les vies oncogèniques regulades per SOX11 mitjançant els models in vitro i in vivo, els hem validat en tumors humans primaris del LCM. S’han obtingut dos treballs d’investigació dels estudis que composen aquesta tesi doctoral, publicats a la prestigiosa revista d’hematologia Blood els anys 2013 i 2014. En ambdós treballs hem estudiat els mecanismes moleculars regulats per SOX11 responsables de la patogènesi i el desenvolupament maligne del LCM. El primer treball es centra en la caracterització del bloqueig del desenvolupament dels limfòcits B madurs degut a la sobre-expressió de SOX11 en el LCM, suggerint un diferent desenvolupament en la formació dels subtipus de LCM agressius i indolents. A més, també demostrem que SOX11 és indispensable pel creixement del LCM ja que tumors SOX11-negatius inoculats en ratolins SCID presenten un creixement menor comparat amb els tumors SOX11-positius. En el segon treball hem identificat, per primera vegada, la funció oncogènica de SOX11 en el LCM ja que regula processos angiogènics responsables del major creixement de les cèl·lules SOX11-positives. D’altra banda també mostrem noves aproximacions terapèutiques per aquest tipus de tumor que ajudarien a una millor estratificació i classificació dels pacients de LCM. Al primer article ens hem centrat en identificar les possibles funcions biològiques de SOX11 en el LCM. Combinant anàlisis de microarray d’immunoprecipitació de cromatina i perfil d’expressió diferencial després de silenciar l’expressió de SOX11, hem identificat gens diana i programes transcripcionals regulats per SOX11, incloent el bloqueig de la diferenciació de la cèl·lula B madura, la modulació del cicle cel·lular, l’apoptosi i el desenvolupament de cèl·lules mare. PAX5 apareix com un dels gens diana directes més significatius de SOX11. El silenciament de SOX11 disminueix l’expressió de PAX5, indueix la de BLIMP1 i promou el canvi de fenotip de cèl·lula B madura a la diferenciació plasmacítica inicial, tant en cèl·lules tumorals primàries del LCM com en un model in vitro. Els nostres resultats suggereixen que SOX11 contribueix al desenvolupament tumoral mitjançant la modulació del programa de la diferenciació terminal de la cèl·lula B en el LCM. A més, hem demostrat l’habilitat tumorigènica de SOX11 in vivo mitjançant un model de xenotransplantament de LCM en ratolins SCID. La reducció significativa del creixement tumoral de les cèl·lules amb expressió de SOX11 silenciada comparada amb el creixement de les cèl·lules de LCM amb alts nivells d’expressió de SOX11 dels xenotransplantaments, demostra la implicació de l’expressió de SOX11 en el comportament agressiu d’aquest limfoma. SOX11 se sobre-expressa en diferents tumors sòlids i en la majoria de LCM agressius. En el primer article constituent d’aquesta tesi doctoral hem demostrat que el silenciament de l’expressió de SOX11 redueix el creixement tumoral en un model de xenotransplantament, consistent amb el curs clínic indolent dels pacients del LCM SOX11-negatius. Tot i així, els mecanismes oncogènics directament regulats per SOX11 encara no s’han descrit. Per tant, en el segon treball ens hem centrat en la identificació i caracterització molecular de dits mecanismes. Hem observat que els tumors dels xenotransplantaments murins així com de pacients de LCM SOX11-positius estan enriquits en vies gèniques relacionades amb l’angiogènesi, i presenten una major densitat de microvasos comparada amb els tumors derivats dels xenotransplantaments i els tumors humans primaris SOX11-negatius. A més, el medi cel·lular condicionat derivat de cèl·lules SOX11-positives indueix una major proliferació, migració, formació de tubs, i activació de vies de senyalització angiogèniques en cèl·lules endotelials in vitro. Hem identificat el factor pro-angiogènic PDGFA com un gen diana directe de SOX11 en cèl·lules de LCM, la inhibició del qual elimina els efectes angiogènics accentuats en cèl·lules endotelials in vitro. Per altra banda, PDGFA està sobre-expressat en cèl·lules SOX11-positives tant en cultius cel·lulars de LCM, xenotransplantaments com en pacients de LCM. In vivo, el tractament dels xenotransplantaments SOX11-positius amb el fàrmac imatinib, un inhibidor del receptor de PDGFA, disminueix la neo-vascularització i el creixement tumoral de dites cèl·lules, equilibrant-lo al creixement tumoral de les cèl·lules SOX11-negatives. El nostre estudi identifica, per primera vegada, que SOX11 regula senyals de supervivència angiogèniques en el LCM, demostrant la seva implicació oncogènica en el comportament i progressió agressius d’aquest tumor maligne. A més a més, recalca la via SOX11-PDGFA com una possible diana terapèutica pel subtipus agressiu del LCM, una malaltia en la que encara actualment hi ha poques opcions terapèutiques duradores i complertes. En general, les conclusions d’aquest treball de tesi doctoral han estat les següents: 1. Identificació dels gens diana i les vies transcripcionals regulades per SOX11 en el LCM mitjançant experiments in vitro i in vivo. 2. Caracterització del bloqueig de la diferenciació dels limfòcits B madurs com a mecanisme del desenvolupament dels diferents subtipus de LCM agressius i indolents. Dit bloqueig està mediat per la sobre-expressió de PAX5 mitjançant SOX11. 3. Demostració de la implicació oncogènica de SOX11 en la patogènesi del LCM. 4. Caracterització de la regulació de processos angiogènics per part de SOX11 com a mecanisme oncogènic responsable del creixement tumoral del LCM agressiu. Dita regulació està mediada per la sobre-expressió de PDGFA mitjançant SOX11. 5. Identificació de possibles noves dianes terapèutiques en el LCM.