MHM region of Gallus gallus domesticus: DNA methylation pattern, copy number and sexing

As aves apresentam o sistema de cromossomos sexuais ZZ/ZW (macho e fêmea, respectivamente). Os mecanismos de determinação sexual para esses animais parecem envolver genes Z- e W-específicos. Há evidências de que mecanismos epigenéticos possam estar associados, incluindo neste caso a região hipermetilada no macho (male hypermethylated ou MHM), a qual é transcrita em um RNA não codificante que se acumula próximo ao sítio de transcrição, de forma similar ao que ocorre com o RNA Xist (X-inactive specific transcript). No entanto, não há dados suficientes que demonstrem a existência de um mecanismo de compensação de dose em aves. Os objetivos do presente projeto foram caracterizar, por meio de técnicas de biologia molecular, o padrão de metilação da região MHM em Gallus gallus domesticus e criar um teste de sexagem baseado no número de cópias da região MHM, presente no cromossomo Z. O DNA foi extraído de diferentes tecidos (pena, coração, cérebro, gônada, rim, pulmão, fígado, músculo e sangue) de oito animais adultos e vinte filhotes. O padrão de metilação da região MHM foi caracterizado por meio de sequenciamento de DNA pós-modificação com bissulfito de sódio. Identificamos os pontos de metilação da região estudada, que apresentou um padrão hipermetilado (92,3%) nas amostras provenientes de macho e um padrão hipometilado (2,1%) nas amostras de fêmea. O teste de sexagem por PCR tempo real quantitativa (qPCR) baseado no número de cópias da região MHM apresentou um acerto de 100% para todos os tecidos analisados, no entanto, os parâmetros utilizados para o DNA proveniente de fígado devem ser diferentes dos demais tecidos. Não encontramos diferença no número total de cópias da região MHM entre os animais do mesmo sexo, mas identificamos diferenças no número de cópias da região MHM entre os tecidos de um mesmo animal, sendo que o que apresenta o menor número de cópias da região MHM é o fígado, seguido por músculo, rim, coração, pulmão, gônada, cérebro e sangue. Além disso, verificamos uma nítida diferença entre o número de cópias da região MHM no DNA de fígado de filhotes e adultos, sugerindo que os pintinhos iniciam a sua vida com um número menor de cópias da região MHM no DNA do fígado e vão ganhando cópias ao longo da vida, até atingir os valores encontrados nos adultos. Os resultados abrem as portas para a elaboração de novas perguntas e formulação de novas hipóteses, além de esclarecer pontos importantes sobre essa complexa região, envolvida no processo de compensação de dose e determinação sexual das galinhas. Birds have the ZZ/ZW sex chromosome system (male and female, respectively). The mechanisms of sexual determination for these animals appear to involve Z- and Wspecific genes. There is evidence that epigenetic mechanisms may be associated, including in this case the male hypermethylated region (MHM), which is transcribed into a non-coding RNA that accumulates near the transcription site, similarly to what occurs with Xist RNA. However, there is insufficient data to demonstrate the existence of a dose compensation mechanism in birds. The objectives of the present project were to characterize by molecular biology techniques the methylation pattern of the MHM region in Gallus gallus domesticus and to create a sexing test based on the number of copies of the MHM region present on the Z chromosome. DNA was extracted from different tissues (feather, heart, brain, gonad, kidney, lung, liver, muscle and blood) from eight adult animals and twenty chicks. The methylation pattern of the MHM region was characterized by bisulfite sequencing. We identified the methylation points of the studied region, which presented a hypermethylated (92.3%) pattern in samples from male and a hypomethylated (2.1%) pattern in female samples. The sexing test using MHM region copie number by qPCR present a 100% accuracy for all analyzed tissues, however, the parameters used for the DNA from the liver should be different from the other tissues. We found no difference in the total number of MHM region copies among the same sex animals, but we identified differences in the number of MHM region copies between the tissues of the same animal. The tissue with the lowest number of MHM region copies is the liver, followed by muscle, kidney, heart, lung, gonad, brain and blood. In addition, we found a clear difference between the number of copies of the MHM region in the liver DNA of chicks and adults, suggesting that the chicks start their life with fewer copies of the MHM region in the liver DNA and are gaining copies at, to reach the values found in adults. The results found open the possibility to the elaboration of new questions and formulation of new hypotheses, besides clarifying important points about this complex region, involved in the process of dose compensation and sexual determination of the birds.