Veränderung der neuronalen Vasoregulation im mesenterialen Gefäßbett bei portaler Hypertension: mit besonderem Fokus auf die neuronale Stickstoffmonoxyd-Synthase (nNOS)-vermittelte Vasorelaxation und die Neuropeptid Y (NPY)-induzierte Vasokonstriktion

Veränderung der neuronalen Vasoregulation im mesenterialen Gefäßbett bei portaler Hypertension: mit besonderem Fokus auf die neuronale Stickstoffmonoxyd-Synthase (nNOS)-vermittelte Vasorelaxation und die Neuropeptid Y (NPY)-induzierte Vasokonstriktion. Hintergrund und Ziele: 1. Die splanchnische arterielle Vasodilatation ist ein pathophysiologische Faktor bei der Entwicklung des hyperdynamen Zirkulationssyndroms. Die Dilatation konnte auf eine vaskuläre NO-Überproduktion zurückgeführt werden. Die n(euronale)-NOS wurde bisher nicht untersucht, und von daher ist das Ziel dieser Arbeit die nNOS-Protein Expression und die nNOS-vermittelte Vasorelaxation an portal-venös-ligierten Ratten zu charakterisieren. 2. HSP90 stimuliert die Aktivität der nNOS. Bislang konnte noch nicht nachgewiesen werden, dass die nNOS-Aktivität in PVL-Ratten aufgrund von HSP90 größer ist, als in Sham-Ratten. Um eine direkte Interaktion von nNOS/HSP90 nachzuweisen wurde eine Co-Immunpräzipitation durchgeführt. 3. Die kompensatorische Stimulation des sympathischen Nervensystems konnte anhand von gesteigerten Serumspiegeln an Noradrenalin (NA) gezeigt werden. Neuropeptide Y (NPY) liegt zusammen mit NA in präsynaptischen Vesikeln vor, wird nach starker sympathischer Nervenstimulation sezerniert und wirkt als ein Cotransmitter. Veränderungen in der Freisetzung und den vasoaktiven Effekten von NPY in der splanchnischen Zirkulation bei Hypertension wurden bisher noch nicht untersucht. In der folgenden Studie wurde zudem noch der Effekt von NPY auf die nNOS-vermittelte Vasodilatation analysiert. Methoden: 1. Das mesenteriale Gefäßbett wurde mittels Immunhistochemie nNOS-spezifisch gefärbt, und die nNOS-Proteinmenge mittels Wester Blot quantifiziert. Das deendothelisierte mesenteriale Gefäßbett wurde in vitro perfundiert und mit NA präkonstriktiert (EC80). Durch eine periarterielle Nervenstimulation (PNS, 2-12 Hz, 45V) wurde die Vasodilatation durch Zugabe des Inhibitors L-NAME (10-4 M) und des nNOS-spezifischen Hemmstoffes TRIM (10-4 M) untersucht. 2. Das Protokoll für die Untersuchung des Einflusses von HSP90 auf die nNOS-vermittelte Vasorelaxation bei PVL-/Sham-Ratten ist identisch mit dem oben beschriebenen Protokoll. Anstelle von L-NAME wurde Geldanamycin (10-4 M) vor dem zweiten Perfusionszyklus zugegeben. 3. Der Einfluss von NPY (10-8 M) auf die vaskulären Effekte von Methoxamin (MT: alpha1-adrenerger -Agonist) wurde durch Perfusion des mesenterialen Gefäßbettes beider Tiergruppen untersucht. Zur Charakterisierung des Einflusses von NPY auf die nNOS-vermittelte Vasorelaxation wurde das gleiche Versuchsprotokoll-wie oben erwähnt-verwendet; und dabei NPY vor dem zweiten Perfusionszyklus in einer Konzentration von 8 x 10-8 M zugegeben. Ergebnisse: 1. nNOS ist in der Adventitia von mesenterialen Gefäßen lokalisiert, wobei die PVL-Tiere eine deutlich stärke Färbung zeigten. Die Proteinmenge in den mesenterialen Arterien der PVL-Tiere stark erhöht. Die PNS führte zu einer frequenzabhängigen Vasorelaxation, die in den PVL- stärker ausgeprägt war. Dieser Unterschied der neuronal-vermittelten Vasorelaxation wurde durch die Gabe von L-NAME/TRIM aufgehoben. Der Effekt der Hemmung von der nNOS-vermittelten Vasorelaxation war bei den PVL-Tieren signifikant größer als bei Sham-Tieren. 2. Die Co-Immunpräzipitation zeigte eine Interaktion von HSP90 und nNOS. Durch Geldanamycin wurde der Unterschied zwischen den PVL- und Sham-Ratten aufgehoben, der Effekt der verminderten NO-Freisetzung bei den PVL-Tieren war signifikant größer. Geldanamycin erwies sich als ein ähnlich guter Inhibitor wie L-NAME. 3. Die vaskuläre Hyporeaktivität gegenüber MT im mesenterialen Gefäßbett von PVL-Tieren wurde durch NPY korrigiert. NPY steigerte die vaskuläre Sensitivität, führte aber nur bei den PVL-Tieren zu einer gesteigerten Kontraktilität. Die durch NPY bedingte Änderung der MT-Antwort war bei den PVL-Ratten signifikant stärker als bei den Sham-Tieren. Die Gabe von NPY führte zu einer Hemmung der nNOS-vermittelten Vasorelaxation. Schlussfolgerung: 1. Die perivaskuläre nNOS Protein Expression ist im mesenterialen Gefäßbett bei portaler Hypertension erhöht und bedingt eine gesteigert NO-vermittelte Vasorelaxation. Diese nNOS-abhängige NO Überproduktion könnte eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der arteriellen Vasodilatation und beim hyperdynamen Zirkulationssyndrom spielen. 2. Die HSP90/nNOS Interaktion verstärkt die PNS-vermittelte NO-Freisetzung. Diese Ergebnisse zeigen, dass der größte Teil der nNOS-vermittelten Vasorelaxation im mesenterialen Gefäßbett bei portaler Hypertension durch HSP90 moduliert wird. 3. Der vasokonstriktive Effekt von NPY im mesenterialen Gefäßbett ist im Vergleich bei den PVL-Tieren stärker ausgeprägt. NPY stellt die vaskuläre Hyporeaktivität wieder her und ist somit ein Agens was die vaskulär verminderte Antwort auf Konstriktoren bei portaler Hypertension wieder herstellt.

Alterations of the neuronal vasoregulation in the mesenteric vasculature during portal hypertension: special focus on neuronal nitric oxide synthase (nNOS) induced vasorelaxation and neuropeptide Y (NPY) induced vasoconstriction. Background and Aims: 1. Splanchnic arterial vasodilatation is the pathophysiological hallmark in the development of the hyperdynamic circulation in portal hypertension. This has been attributed largely to vascular NO overproduction. So far, n(euronal)-NOS has not been investigated and hence, the current study evaluates nNOS-protein expression and nNOS-mediated vasorelaxation in a model of portal vein-ligated rats (PVL). 2. Furthermore it has been investigated that HSP90 stimulates the nNOS-activity. In this respect it has not been characterized the role of HSP90 on the nNOS activity in PVL-rats. To detect a direct nNOS/HSP90 interaction a Co-Immunprecipitation has been done. 3. Compensatory stimulation of the sympathetic nervous system has been evidenced by increased serum levels of norepinephrine (NE). Neuropeptide Y (NPY) is co-stored with NE in pre-synaptic vesicles, is released upon sympathetic nerve stimulation and functions as co-transmitter. Alterations in release and vasoactive effects of NPY in the splanchnic circulation in portal hypertension have not been investigated so far. In a further study the effect of NPY to the nNOS-mediated vasodilatation was analyzed. Methods: 1. Mesenteric vasculature of PVL and sham rats was stained for nNOS immunohistochemically and analyzed for nNOS-protein level by western blot. In-vitro perfused de-endothelialized mesenteric arterial vasculature were preconstricted with norepinephrine (EC80) and tested for nNOS-mediated vasorelaxation by periarterial nerve stimulation (PNS, 2-12 Hz, 45V) before and after incubation with the non-specific NO-inhibitor L-NAME (10-4 M) or nNOS-specific inhibitor TRIM (10-4 M), respectively. 2. The protocol for the experiments, to evaluate the effect of HSP90 in PVL-/sham-rats, is similar to the one mentioned above. Though instead of L-NAME it has been given Geldanamycin (10-4 M) before the second perfusion cycle. 3. The effect of NPY (10-8 M) on vascular reactivity to methoxamine (MT: alpha1-adrenergic agonist) was evaluated in the in-vitro perfused mesenteric vascular bed of portal-vein-ligated (PVL) and sham operated (sham) rats. To determine the effect of NPY to the nNOS-mediate vasorelaxation the protocol mentioned above (1./2.) has been uses. The neuromodulator NPY was given before the second perfusion cycle in a concentration of 8 x 10-8 M. Results: 1. nNOS was localized to the adventitia of the mesenteric arterial tree showing more intense staining in PVL as compared to sham rats. Correspondingly, nNOS protein expression was markedly up-regulated in mesenteric arteries in PVL rats. PNS induced a frequency-dependent vasorelaxation which was more pronounced in PVL as compared to sham rats. This difference in nerval-mediated vasorelaxation was abolished by incubation with L-NAME or TRIM, respectively. The effect of NO-inhibition on nNOS-mediated vasorelaxation was significantly greater in PVL than in sham animals. 2. The co-immunprecipitation showed a direct interaction of HSP90 and nNOS. This finding could be confirmed through the administration of Geldanamycin before the second perfusion cycle. The difference between PVL- and sham-rats has been eliminated in which the effect of NO-inhibition was significantly greater in PVL- than in sham-rats. Furthermore Geldanamycin inhibited the nNOS-mediated effect as good as L-NAME. 3. The well-known marked vascular hyporeactivity to MT in the mesenteric vascular bed of PVL rats was corrected by NPY. NPY increased vascular sensitivity in both study groups equally but enhanced vascular contractility only in PVL rats. Percentage change in maximal pressure response to MT (alpha1-agonist) induced by NPY was significantly more pronounced in PVL rats as compared to sham animals. Furthermore NPY inhibited the nNOS-mediated vasoralaxation as good as L-NAME or Geldanamycin. Conclusion: 1. Perivascular nNOS protein expression is enhanced in mesenteric arteries in portal hypertension mediating an increased nerval NO-mediated vasorelaxation. This nNOS-derived NO overproduction may play an important role in the pathogenesis of arterial vasodilation and hyperdynamic circulatory syndrome in portal hypertension. 2. The binding of HSP90 to nNOS increases the PNS-mediated NO release. The experiments point to the fact that the main part of the nNOS-mediated vasorelaxation in portal hypertension in the mesenteric vasculature is modulated by HSP90. 3. The vasoconstrictive effect of NPY in the mesenteric vasculature is markedly more pronounced in PVL than in sham rats restoring vascular responsiveness and making NPY a superior vasoconstrictive candidate to overcome vascular hyporesponsiveness in portal hypertension.