Etude du rôle de l’autophagie et des protéines ATG8 dans l’apprêtement et la présentation de l’antigène OVALBUMINE par les protéines de classe II du Complexe majeur d’histocompatibilité

Autophagy plays an important role in immunity by delivering peptides for the antigen presentation. Among the effectors of autophagy, the ATG8 proteins have been described to play a key role in the elongation and maturation of the autophagosome, before its fusion with the lysosome. The mammalian ATG8 family comprises the LC3 subfamily (LC3A, B and C) and the GABARAP subfamily (GABARAP, GABARAPLl and GABARAPL2). ln 2016, a study reported that the fusion between the cancer testis antigen NY-ESO-1 and the N-ter of the autophagy protein LC3B could enhanced NY-ESO-1- restricted CD4+ T cell response. The aim of our study was to demonstrate that GABARAP/GABARAPLl, as well as LCB could be used to target antigens to the autophagie pathway. The OVALBUMIN (OVA) antigen was chosen to take advantage of the OT-1 and OT-11 mice which express a transgenic TCR specific for OVA peptides in their CD4 and CD8 T cells. B16-Fl0 stable cell lines overexpressing OVA, OVA-LC3B, OVA-GABARAP or OVA-GABARAPLl antigens have been established to confirm the ability of the ATG8 proteins to target OVA proteins into the autophagosomes and to present peptides on their class Il MHC molecules. However, B16-OVA-ATG8 overexpressing failed to activate specific CD4+ T cell response. Primary cell cultures of a more physiological antigen presenting cells i.e. bone marrow-derived dendritic cells (DC) were developed to address OVA to the autophagosomes. Here we report for the first time that other members of the ATG8 family proteins, GABARAP and GABARAPLl can target OVA to the autophagosomes and enhanced MHC class Il presentation to activate specific CD4+ T cells. The second aim of our study was to investigate the role of GABARAPLl protein in the presentation of OVA peptides in B16-OVA cells. We generated B16-OVA GABARAPLl-Knock-down (KD) using the CRISPR-Cas9 technology. ln GABARAPLl KD cells, the basal autophagie flux was significantly decreased. When injected into mice, these GABARAPLl KD cells developed a tumour faster in immunocompetent C57BL/6N mice than in immunocompromised (SCID) mice suggesting the involvement of GABARAPLl in the tumour cell proliferation control by the immune system

L'autophagie joue un rôle important dans l'immunité en fournissant des peptides pour la présentation antigénique. Parmi les acteurs essentiels de !'autophagie, les protéines ATG8 jouent un rôle clé dans l'élongation et la maturation de l'autophagosome, avant sa fusion avec le lysosome. La famille ATG8 chez les mammifères comprend la sous-famille LC3 et la sous-famille GABARAP. En 2016, une étude a montré que la fusion de l'antigène de tumeur NY-ESO-1 à la partie N-ter de ATG8/LC3B pouvait améliorer la réponse des lymphocytes T (LT) CD4+ restreints à NY-ESO-1. Le premier objectif de la thèse était de démontrer que GABARAP et GABARAPLl, comme LCB3B, pouvaient être utilisés pour cibler un antigène sur la voie autophagique pour favoriser la présentation peptidique par les molécules de CMH de classe Il. L'OVALBUMINE (OVA} a été choisie comme antigène afin de tirer parti des souris transgéniques pour leur récepteur à l'antigène OT-1 et OT-11 qui stimulent respectivement les LT CD8+ et LT CD4+ spécifiques de peptides issus de OVA. Des lignées cellulaires stables de cellules tumorales de mélanome murin B16-Fl0 surexprimant les antigènes OVA, OVA-LC3B, OVA­GABARAP ou OVA-GABARAPLl ont été établies et utilisées pour activer des LT CD4+ OT-11 spécifiques du peptide OVA. Toutefois, la surexpression de l'antigène OVA-ATG8 dans les cellules B16 n'a pas permis de déclencher une réponse CD4+. Des cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse (DC) en culture primaire constituant un modèle physiologique de présentation antigénique ont été choisies par la suite pour adresser OVA aux autophagosomes. Dans ce modèle, les protéines GABARAP et GABARAPLl comme LC3B peuvent cibler l'antigène OVA aux autophagosomes et augmenter sa présentation par les molécules du CMH-11 améliorant la réponse CD4. Le deuxième objectif de cette thèse a été d'étudié le rôle de la protéine GABARAPLl exprimée par les cellules B16-OVA dans la croissance tumorale. L'expression de GABARAPLl a été invalidée dans ces cellules par la technologie CRISPR-Cas9 et le rôle spécifique de GABARAPLl dans la présentation des antigènes par les protéines du CMH-11 a été étudié. Chez les cellules B16-OVA GLl-/-, le flux autophagique basal est significativement diminué. Ces cellules ont montré une augmentation significative de leur croissance tumorale dans des souris immunocompétentes C57BL/6N mais pas dans des souris immunodéprimés (SCID) suggérant un rôle de GABARAPLl dans l'implication du système immunitaire contrôlant la prolifération cellulaire