Χαρακτηρισμός στελεχών Klebsiella pneumoniae από διεισδυτικές λοιμώξεις
2022
Online
unknown
Zugriff:
Σκοπός: Με τη μελέτη αυτή, έγινε προσπάθεια καταγραφής των κυρίων χαρακτη-ριστικών των νοσοκομειακών στελεχών Klebsiella pneumoniae που απομονώθηκαν από ασθενείς με μικροβιαιμία, καθώς επίσης και προσπάθεια προσδιορισμού παραγόντων που ευθύνονται για τη λοιμογόνο δράση τους, με έμφαση στον πανδημικό κλώνο ST258. Συγκεκριμένα, εξετάσαμε: α) την ύπαρξη γονιδίων που προσδίδουν στα στελέχη ST258 αυξημένη λοιμογονικότητα, β) την ευαισθησία των στελεχών ST258 στον ορό και το συμπλήρωμα, γ) την φαγοκυττάρωσή τους από μακροφάγα, δ) τη λοιμογονικότητά τους in vivo σε ζωικό μοντέλο σήψης και ε) την ικανότητά τους να εγείρουν το εγγενές ανοσοποιητικό σύστημα, όπως αυτό εκφράζεται με την παραγωγή των προφλεγμονωδών κυτταροκινών IL-1β, IL-6, TNF-α, καθώς και με την μεταγραφική ικανότητα της IL-1β και του πρωτεϊνικού συμπλέγματος NLRP3 του φλεγμονοσώματος, τα οποία έχουν καθοριστικό ρόλο στην ενεργοποίηση της πρωτογενούς ανοσιακής απάντησης του οργανισμού. Μεθοδολογία: Ελέγχθηκαν συνολικά 190 στελέχη K. pneumoniae που απομονώ-θηκαν από ασθενείς με μικροβιαιμία σε 2 μεγάλα τριτοβάθμια νοσοκομεία της Αθήνας, κατά την περίοδο 1/8/2009 έως 30/11/2010. Έγινε έλεγχος για την παραγωγή καρβαπενεμασών με δίσκους εμποτισμένους με EDTA, βορονικό οξύ και συνδυασμό αυτών καθώς και προσδιορισμός γονιδίων blakpc και blavim, με PCR. Ακολούθησε μοριακή τυποποίηση με PFGE 123 στελεχών που είχαν τυποποιηθεί ως KPC. Στη συνέχεια, έως και 2 στελέχη από κάθε PFGE-κλάσμα (cluster) ελέγχθηκαν για 7 γονίδια (gapA, infB, mdh, pgi, phoE, rpoB και tonB), με MLST. Από τον κλώνο ST258 επελέγησαν 3 στελέχη από τα PFGE-κλάσματα με υπερίσχυση του κλώνου ST-258, και προσδιορίστηκε ο ορότυπος κάψας. Σε στέλεχος αντιπροσωπευτικό του κλώνου ST258 (L-78, κλάδος Ι), καθώς και στο υπερλοιμογόνο στέλεχος ATCC 43816 (ορότυπος Κ2) το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας, ελέγχθηκε η ευαισθησία στη βακτηριοκτόνο δράση ορού υγιών εθελοντών και η φαγοκυττάρωσή τους από την κυτταρική σειρά J774A.1 μακροφάγων ποντικού BALB/c. Έγινε επίσης in vivo εξέταση της λοιμογονικότητας των στελεχών L-78 και ATCC 43816 σε μοντέλο σήψης, μετά από πρόκληση λοίμωξης ανοσοεπαρκών και ουδετεροπενικών θηλυκών ποντικών ICR. Σε 20 στελέχη έγινε έλεγχος με PCR μιας σειράς γονιδίων που προσδίδουν αυξημένη λοιμογονικότητα (magA, alls, rmpA, mrkD, kfu, cf29a, fimH, uge, wabG, urea, ybtS, entB/entE και iroN). Τέλος, έγινε μελέτη της ανοσολογικής απάντησης σε κυτταροκαλλιέργειες μακροφάγων ποντικού, μετά από διέγερσή τους με τα στελέχη K. pneumoniae: L-78 (ST258, κλάδος Ι) και ATCC 43816 (μάρτυρας), καθώς και με LPS, και προσδιορίστηκαν οι προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες IL-1β, ΙL-6 και ΤNF-α με τη μέθοδο ELISA. H μεταγραφική ικανότητα της IL-1β και του πρωτεϊνικού συμπλέγματος NLRP3 του φλεγμονοσώματος εξετάστηκαν με τη μέθοδο της αντίστροφης μεταγραφής σε μια ποσοτική-πραγματικού χρόνου qPCR, με προσδιορισμό της έκφρασης του mRNA. Αποτελέσματα: Στα 190 στελέχη βρέθηκαν 38 VIM, 29 KPC-VIM και 123 KPC. Τα στελέχη αυτά διαχωρίστηκαν σε 13 κλάσματα (clusters) με PFGE. Κατά τον έλεγχο με MLST, διαπιστώθηκε υπεροχή του κλώνου ST258 και ο ορότυπος προσδιορίστηκε ως Κ41. Από τον έλεγχο ευαισθησίας στον ορό, ευρέθη ότι το στέλεχος L-78 ήταν ευαίσθητο στο συμπλήρωμα, σε αντίθεση με το υπερλοιμογόνο στέλεχος ATCC 43816. Όσον αφορά στη φαγοκυττάρωση, ευρέθη ότι το στέλεχος L-78 φαγοκυτταρώθηκε ταχύτατα σε αντίθεση με το στέλεχος ATCC 43816. Επίσης το στέλεχος L-78 δεν ήταν ικανό να θανατώσει τα ανοσοεπαρκή πειραματόζωα, ακόμη και σε μεγαλύτερη συγκέντρωση μικροβιακού φορτίου, σε αντίθεση με το στέλεχος ATCC 43816. Σε 20 στελέχη του κλώνου ST258 που ελέγχθηκαν, εντοπίστηκαν τα γονίδια αυξημένης λοιμογονικότητας urea, uge, wabG, fimH, mrkD, entB/entE και ybtS. Ωστόσο, στερούνταν των γονιδίων magA, alls, kfuBC, cf29a, rmpA και iroΝ, τα οποία απαντώνται συνήθως σε υπερλοιμογόνα στελέχη. Aπό την ανοσιακή απάντηση σε κυτταροκαλλιέργειες μακροφάγων ποντικού, φάνηκε ότι το στέλεχος L-78 ενεργοποίησε τα μακροφάγα και παρήγαγε υψηλά επίπεδα προφλεγμονωδών κυτταροκινών (IL-1β, IL-6, και TNF-α). Το στέλεχος L-78 ήταν ικανό να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή των γονιδίων του NLRP3 και της IL-1β. Συμπέρασμα: Τα στελέχη K. pneumoniae που απομονώθηκαν από το αίμα ασθενών σε Ελληνικά νοσοκομεία παρήγαγαν κυρίως KPC και ανήκαν στον κλώνο ST258. Το αντιπροσωπευτικό στέλεχος του κλάδου Ι του ST258 που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη, ήταν ευαίσθητο στη δράση του συμπληρώματος και τη φαγοκυττάρωση, και γενικά είχε χαρακτηριστικά ελαττωμένης λοιμογονικότητας. Επίσης ενεργοποίησε τα μακροφάγα, ώστε να παραγάγουν υψηλά επίπεδα προφλεγμονωδών κυτταροκινών και προκάλεσε στατιστικά σημαντικά υψηλότερη έκλυση IL-1β σε σχέση με ένα υπερλοιμογόνο στέλεχος. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν, ότι τα στελέχη ST258, ενώ είναι χαμηλής λοιμογονικότητας, είναι ικανά να προκαλέσουν τη διέγερση του εγγενούς ανοσοποιητικού συστήματος. Background: In this study we attempted to record characteristics of Klebsiella pneumoniae nosocomial strains isolated from patients with bacteremia, as well as to identify factors responsible for their virulence, with emphasis on the pandemic ST258 clone. More specifically, we studied: a) virulence genes in ST258 strains, d) the sensitivity of ST258 strains in serum and complement, c) their phagocytosis by macrophages, d) their virulence in a in vivo animal sepsis model, and e) their ability to elicit adequate innate immune responses in terms of production of the pro-inflammatory cytokines IL-1β, IL-6, and TNF-α. Materials and methods: A total of 190 Klebsiella pneumoniae strains, isolated from bloodstream infections (BSI) in two large tertiary hospitals in Athens during the period 1/8/2009 to 30/11/2010, were tested. For the production of carbapenemases, the EDTA and boronic acid disk test was performed, as well as gene sequencing of blakpc and blavim genes by PCR. Molecular typing of 123 strains identified as KPC-producing, was performed with PFGE. Subsequently, up to 2 strains from each PFGE-cluster, were tested for 7 genes (gapA, infB, mdh, pgi, phoE, rpoB and tonB), by MLST. Three strains belonging to ST258 clone were selected from the PFGE clusters with ST-258 clone predominance and were serotyped. Strain L-78, representative of ST258, clade I, and the hypervirulent strain ATCC 43816 (serotype K2), were evaluated for complement sensitivity in serum of healthy volunteers and phagocytosis by the cell line J774A.1. In vivo evaluation of the virulence of strains L-78 and ATCC 43816 was also performed in a sepsis model, following infection of immunocompetent and neutropenic female ICR mice. In 20 strains, PCR was performed for a series of genes conferring increased virulence (magA, alls, rmpA, mrkD, kfu, cf29a, fimH, uge, wabG, urea, ybtS, entB / entE and iroN). Finally, the immune response of mouse macrophage cell cultures after stimulation with the strains of K. pneumoniae: ATCC 43816, L-78 and LPS was studied, and production of the proinflammatory cytokines IL-1β, IL-6 and TNFα, were measured by ELISA LUMINEX. NLRP3 inflammasome and IL-1 mRNA expression was examined with reverse transcription in a quantitative-real time PCR (qPCR). Results: The 190 strains were identified as: VIM (38), KPC-VIM (29) and KPC (123). These strains were separated into 13 clusters by PFGE. MLST analysis revealed that most strains belonged to ST258 clone and K41 serotype. Serum bactericidal activity testing showed that the L-78 was sensitive to complement, in contrast to the highly virulent strain ATCC 43816. With respect to phagocytosis, strain L-78 was phagocytosed rapidly, unlike the strain ATCC 43816. In addition, the L-78 strain was not able to kill immunocompetent animals, even at higher concentration of the bacterial load, in contrast to strain ATCC 43816. In 20 strains of the ST258 clone, genes of high virulence such as urea, uge, wabG, fimH, mrkD, entB/entE and ybtS, were detected. Genes usually found in hypervirulent strains: magA, alls, kfuBC, cf29a, rmpA and iroΝ, were lacking. Evaluation of the immune response in murine macrophage cell cultures showed that strain L-78 activated macrophages and produced high levels of proinflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, and TNF-α). Strain L-78 was able to activate the transcription of NLRP3 inflammasome and IL-1β. Conclusion: K. pneumoniae strains isolated from BSI in Greek hospitals were mostly KPC producing and belonged to clone ST258. The ST258 representative strain used in the present study was sensitive to complement activation and phagocytosis and was practically avirulent. It also activated macrophages to produce high levels of proinflammatory cytokines. Our results show that KPC-producing K. pneumoniae ST258 strains, although practically avirulent, are capable of eliciting adequate innate immune response.
Titel: |
Χαρακτηρισμός στελεχών Klebsiella pneumoniae από διεισδυτικές λοιμώξεις
|
---|---|
Autor/in / Beteiligte Person: | Asimina, Balaska |
Link: | |
Veröffentlichung: | 2022 |
Medientyp: | unknown |
Schlagwort: |
|
Sonstiges: |
|