In vitro morphogenesis in eggplant and tomato plants and silencing of myo-inositolfosfate sintase gene by RNAi in tomato plants

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais The main objectives in this work were: i) to find the optimum conditions to disinfect tomato seeds (Solanum lycopersicum Mill.) and eggplant seeds (Solanum melongena L.); ii) to evaluate the influence of the type of sealing in the obtained seedlings and explants; iii) to evaluate the effect of sonication in the morphogenesis in vitro of the tomato explants and in the viability of Agrobacterium tumefaciens cells; iv) to establish the parameters that allow the genetic transformation mediate by A. tumefaciens aiming the genetic silencing mediate by RNAi from myo-inositol-phosphate synthase, using the GmMPIS1 gene. It was checked that the use of deionized water was more efficient to disinfect eggplant seeds than 0.13% v/v chlorine solution. The use of dry disinfection in chlorine cameras is not appropriate to clean the tomato and eggplant seeds due to the gas toxicity and that it also compromises their germination. It was observed that gas exchange helps the seedlings development and leads to a bigger number of explants and with better quality to be used in the genetic transformation via Agrobacterium tumefaciens. Using the SAAT technique (Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation), the explants and the bacteria suspensions were exposed to ultrasound for 0, 3, 6 and 9 seconds. It was verified that the immersion time from 3 to 6 seconds was appropriate to be used in genetic transformation, since it shown the biggest transient expression areas evaluated by in situ histochemical analysis of the GUS gene, the biggest number of regenerated structures and less mortality in the A. tumefaciens cells. The process was optimized when the immersion of the A. tumefaciens suspension was made 24 hours after the exposition to ultrasound. To make possible to select the transformed plants it was established the dependence of the hygromycin agent lethality and the found concentration of the non-transformed selected cells was 7.5 mg.L-1 in cotyledonary hipocotyledonary and leaf tomato explants. It was found that concentrations above this value were toxic, showing chlorotic and necrotic areas in the explants. A genetic transformation in tomato and eggplant plants was successfully made to check the relation between the MIPS gene and the seeds development by A. tumefaciens containing plasmids with silencing construction by siRNA to the MIPS gene using a conserved sequence of the soy gene GmMIPS. The transgenic nature of the primary regenerators was confirmed by in situ histochemical tests of GUS and by PCR analysis with specific oligonucleotides initiators. The analysis of the genetic expression confirmed the MIPS gene silencing and the morphologic analysis of the fruits confirmed the hypothesis of the relationship between the myo-inositol- phosphate synthase and the seeds development. However, as shown by flow-citometry technique, the process of regeneration in vitro used in the tomato plants transformation protocol changed some transgenic plants to polypoids. This was not observed in eggplant plants. Este trabalho teve como objetivo: i) a otimização das condições de desinfestação de seentes de tomateiros (Solanum lycopersicum Mill.) e berinjela (Solanum melongena L.); ii) a avaliação da influência do tipo de vedação sobre a qualidade das plântulas e explantes oriundos destas; iii) a avaliação do efeito da sonicação sobre a morfogênese in vitro de explantes de tomateiros e sobre a viabilidade de células de Agrobacterium tumefaciens; iv) o estabelecimento de parâmetros para possibilitar a transformação genética mediada por A. tumefaciens visando ao silenciamento gênico mediado por RNAi da sintase do mio-inositol-fosfato, utilizando-se o gene GmMIPS1. Na desinfestação das sementes de berinjela, comprovou-se que tratamentos utilizando imersão em água deionizada são mais eficientes que imersão em solução de 0,13% v/v de cloro. A utilização de desinfestação a seco, em câmara de gás cloro, não é indicada para a assepsia de sementes de tomate e berinjela, pela toxicidade do gás às sementes, comprometendo sua germinação. Observou-se que as trocas gasosas favorecem o desenvolvimento das plântulas e geram explantes em maior número e de melhor qualidade para utilização de transformação genética via Agrobacterium tumefaciens. Ao se utilizar a técnica de SAAT ( Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation ), os explantes e a suspensão bacteriana foram expostos a tempos de exposição ao ultra-som (0, 3, 6 e 9 segundos). Verificou-se que o intervalo de 3 a 6 segundos é o indicado para se utilizar em transformação genética, pois resultou nas maiores áreas de expressão transiente avaliada pela análise histoquímica in situ do gene GUS, maior número de estruturas regeneradas e menor mortalidade nas células de A. tumefaciens. O processo foi otimizado quando a imersão em suspensão de A. tumefaciens foi realizado após 24 horas de exposição ao ultra-som. Para ser possível a seleção de transformantes foi estabelecida a curva de letalidade ao agente higromicina e a concentração encontrada para seleção de células não transformadas foi de 7,5 mg.L-1 em explantes cotiledonares, hipocotiledonares e foliares de tomateiro. Dosagens acima de 7,5 mg.L-1 mostratam-se tóxicas, resultando em explantes com áreas cloróticas e necróticas. A fim de verificar a relação do gene MIPS com o desenvolvimento de sementes, a transformação genética foi realizada com sucesso em tomateiro e berinjela, via A. tumefaciens contendo plasmídeo com construção de silenciamento por siRNA para o gene MIPS, utilizando uma seqüência conservada do gene de soja GmMIPS. A natureza transgênica dos regenerantes primários foi confirmada mediante o teste histoquímico in situ de GUS e análise de PCR com oligonucleotídeos iniciadores específicos. A análise de expresão gênica confirmou o silenciamento do gene MIPS, e a análise morfológica dos frutos confirmou a hipótese do relacionamento da mio-inositol-fosfato-sintase com o desenvolvimento de sementes. Porém, conforme detectado pela técnica de citometria de fluxo, o processo de regeneração in vitro adotado no protocolo de transformação de tomateiro, ao contrário de berinjela, induziu poliploidia em algumas plantas transgênicas.