Reconnaissance spécifique d'ADN double brins : développement de sondes luminescentes

DNA is the biomolecule that contains genetic information. Many diseases are linked to mutations in DNA that result in dysfunctional gene expression. Over the past twenty years, many efforts have been made in biochemistry to develop new tools to detect these mutations that could be interesting for biological or medical research.This thesis project is part of this dynamic and aims to develop a luminescent probe for sequence-specific detection of double-stranded DNA, establishing a proof of concept for the recognition of a double-stranded DNA of 12 selected base pairs. It is based on the development of a system composed of two zinc finger proteins capable of binding to the target DNA, each recognising one half of the sequence. For the luminescence detection, these proteins are equipped with a pair of luminophores that allow resonant Förster-like energy transfer (FRET), which is only active when the proteins are bound to the DNA. First, the chemical synthesis of a luminophore-free protein pair was developed using a native chemical ligation assembly and the recognition of the chosen sequence was demonstrated by electrophoretic mobility shift assay (EMSA) experiments. Next, several bioconjugatable lanthanide complexes were synthesised and those with the best photophysical properties were selected to be grafted onto one of the two proteins, acting as the donor for this FRET system. The second protein was functionalized with an organic fluorophore acting as a FRET acceptor. Finally, we studied by luminescence and electrophoresis (EMSA) the interaction of these proteins with DNA of different sequences and obtained a first proof of concept of the sequence-specific detection by luminescence of a double-stranded DNA of 12 base pairs.; L'ADN est la biomolécule qui contient l'information génétique. De nombreuses maladies sont liées à des mutations de l'ADN qui entraîne l'expression de gènes dysfonctionnelles. Au cours des vingt dernières années, de nombreux efforts ont été déployés en biochimie pour développer de nouveaux outils de détection de ces mutations qui pourraient trouver un intérêt pour la recherche en biologie ou en médecine.Ce projet de thèse s'inscrit dans cette dynamique avec pour but de développer des sondes luminescentes permettant la détection séquence-spécifique d'ADN double brin, en établissant une preuve de concept pour la reconnaissance d'un ADN double brin de 12 paires de bases choisies. Il repose sur la mise au point d'un système de deux protéines à doigts de zinc capable de se lier à l'ADN cible, chacune reconnaissant une moitié de la séquence. Pour la détection par luminescence, ces protéines sont équipées d'une paire de luminophores permettant un transfert d'énergie résonant de type Fôrster (FRET) actif uniquement lorsque les protéines sont fixées à l'ADN. Dans un premier temps, la synthèse par voie chimique d'une paire de protéines sans luminophore a été mise au point en utilisant un assemblage par ligation chimique native et la reconnaissance de la séquence choisie a été démontrée par des expériences de gel-retard (EMSA). Puis la synthèse de plusieurs complexes de lanthanides bioconjugables a été mise au point et ceux présentant les meilleurs propriétés photophysiques ont été retenus pour être greffés sur une des deux protéines, jouant le rôle de donneur pour ce système FRET. La deuxième protéine a été fonctionnalisée avec un fluorophore organique jouant le rôle d'accepteur FRET. Enfin, nous avons étudié par luminescence et gel-retard l'interaction de ces protéines avec des ADN de séquences différentes et obtenu une première preuve de concept de la détection séquence-spécifique par luminescence d'un ADN double brin de 12 paires de bases.