Investigating the effects of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism on human mesenchymal stem cells by using CRISPR/CAS9 system as A gene editing tool

5,10-Metilenetrahidrofolat redüktaz (MTHFR) enzimi folat metabolizmasında önemli bir rol oynar ve C677T tekli nükleotit polimorfizmi(TNP), Türk popülasyonunda en sık görülen mutasyondur ve ilgili enzimin aktivitesinin azalmasına neden olur. Bu polimorfizm yüksek homosistein seviyeleri ile birlikte, literatürdeki birçok farklı hastalıkla ilişkilendirilmiştir. Ayrıca kemik hastalıklarının bir göstergesi olarak kabul edilir ve kemik yoğunluğunun azalmasına yol açarak kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerde (KİMKH'ler) apoptozise neden olan osteoklast oluşumunu tetikler. MKH'lerin başlıca kemik, kıkırdak ve adipoz doku rejenerasyon kaynağı olduğu bilindiğinden, MTHFR C677T polimorfizmi ile MKH farklılaşma kapasitesi arasında bir bağlantı olabileceği düşünülmüştür. Bu nedenle bu projede MTHFR C677T polimorfizminin MKH canlılığı, morfoloji, fizyoloji ve farklılaşma kapasitesi üzerine etkilerini araştırmayı hedefliyoruz. Bu amaçla, MTHFR geni C677T TNP'inin ilgili nükleotit pozisyonu için vahşi tip (C / C), heterozigot (C / T) ve homozigot (T / T) olan kemik iliği kaynaklı birincil insan mezenkimal kök hüclererini (KİMKH) elde ettik. Birincil sonuçlarımız, bu hücrelerin farklılaşma kapasitelerine göre farklı olduğunu ortaya koydu. Ancak bu hastaların farklı genetik geçmişlerine bağlı olabilir. Genetik arka plandaki farklılıkları ortadan kaldırmak, C677T polimorfizmini tanıtmak ve istenen varyatı CRISPR/Cas9 genome düzenleme teknolojisini kullanarak KİMKH'lerin genomuna entegre etmek için bir kılavuz RNA ve bir şablon tek iplikli oligo nükleotidi (ssODN) tasarladık. Ancak hücreler tek hücre olarak elde edilmeye çalışıldığında elde edilemediler ve öldüler. Sonuç olarak, bu çalışma MTHFR C677T SNP'sinin KİMKH'lerin farklılaşma potansiyellerini etkilediğini gösterdi ve altında yatan nedenlerin ortaya çıkarılabilmesi için ileri çalışmaların gerekliliğini ortaya koydu. 5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) enzyme plays an important role in folate metabolism and C677T single nucleotide polymorphism (SNP) is the most frequently seen mutation in Turkish population and it causes MTHFR enzyme activity to decrease. This SNP has been linked to many different diseases in the literature and accompanied with high homocysteine levels. The latter is considered as an indicator of bone diseases and triggers the osteoclast formation, leading to a decrease in bone density and causes apoptosis in bone marrow derived mesenchymal stem cells (MSCs). As MSCs are known to be the major source of bone, cartilage and adipose tissue regeneration, we hypothesized that there could be a link between MTHFR C677T polymorphism and MSC differentiation capacity. That is why in this project, we aim to investigate the effects of MTHFR C677T polymorphism on MSC viability, morphology, physiology and differentiation capacity. For this purpose, we obtained primary human bone marrow derived MSCs (BMMSCs) that are wild type (C/C), heterozygous (C/T) and homozygous (T/T) for MTHFR gene at the corresponding nucleotide position of C677T SNP. Our primary results revealed that these cells were different by their differentiation capacities. However, this may be due to different genetic backgrounds of the patients. To eliminate the differences in genetic background we designed a guide RNA and a template single stranded oligo nucleotide (ssODN) to introduce C677T polymorphism to the genomes of BMMSCs using CRISPR/Cas9 genome editing technology. However, the cells couldn't be obtained as single cells and died. As a result, this study was able to show that the C677T SNP of MTHFR has interference in the differentiation potentials of BMMSCs and it needs further work to investigate the underlying reasons. 194