Portable medical diagnostic devices utilizing innovative responsive polymer film-based biosensors and low-cost transducer for point-of-care applications

Η ανάπτυξη ιατροδιαγνωστικών συσκευών για εφαρμογές στο σημείο περίθαλψης (Point-of-Care, PoC) αποτελεί βασική προϋπόθεση για τη δημιουργία αποκεντρωμένων συστημάτων υγειονομικής περίθαλψης. Ωστόσο, το αυξημένο κόστος και οι πολύπλοκες διεργασίες που απαιτούνται για τη μετατροπή των ήδη υπαρχόντων τεχνολογιών σε συσκευές κατάλληλες για αναλύσεις πεδίου δυσχεραίνουν τη διαδικασία αυτή. Στην πρώτη ενότητα της διατριβής, περιγράφεται η ανάπτυξη μιας φορητής ιατροδιαγνωστικής συσκευής, την οποία ονομάζουμε BioPoC (από τα αρχικά των λέξεων Biosensor και Point-of-Care) που βασίζεται σε βιοαισθητήρες αποκρινόμενων πολυμερικών μεμβρανών και χαμηλού κόστους μεταλλάκτες μέτρησης χρόνου και ηλεκτρικής αντίστασης. Οι βιοαισθητήρες κατασκευάστηκαν με ενζυμικά τροποποιημένες μεμβράνες συμπολυμερούς με απόκριση στο pH. Η λειτουργία τους βασίζεται στη μέτρηση του χρόνου που απαιτείται ώστε η αρχικά άπειρη ηλεκτρική αντίσταση μεταξύ δύο αγώγιμων ταινιών που διαχωρίζονται από τη μεμβράνη, να λάβει μια πεπερασμένη τιμή, ως αποτέλεσμα της εκλεκτικής αποδόμησης της μεμβράνης από τον αναλύτη στόχο και την επαγόμενη πλήρωση ενός κάθετου καναλιού από το υγρό δείγμα, με την οποία επιτυγχάνεται η ηλεκτρική επικοινωνία μεταξύ των δύο αγώγιμων ταινιών. Ο χρόνος αυτός είναι ανάλογος της συγκέντρωσης του αναλύτη. Η συσκευή BioPoC χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της ουρίας σε μη αραιωμένα ούρα χωρίς να προηγηθεί κάποιο στάδιο προκατεργασίας των δειγμάτων. Με την κατάλληλη επιλογή του πάχους της μεμβράνης και της συγκέντρωσης του πολυμερούς από το οποίο κατασκευάστηκε η μεμβράνη, η λειτουργία της συσκευής προσαρμόστηκε στο εύρος συγκεντρώσεων του αναλύτη στα ούρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν εξαιρετική εκλεκτικότητα στα διάφορα συστατικά της μήτρας του δείγματος και πολύ καλή συσχέτιση με τα αποτελέσματα της πρότυπης μεθόδου αναφοράς. Στη δεύτερη ενότητα προτείνεται μία νέα συσκευή και ένας νέου τύπου βιοαισθητήρας, σε μορφή κάρτας SIM, που βασίζεται σε ένα κάθετο κανάλι ροής σε χαρτί τροποποιημένο με συμπολυμερή αποκρινόμενα στο pH. Ο βιοαισθητήρας ενσωματώθηκε σε μία συσκευή που έχει τη δυνατότητα απομακρυσμένης σύνδεσης με έξυπνα κινητά, και χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της κρεατινίνης στα ούρα. Αρχικά, ένα κάθετο μικρορευστομηχανικό κανάλι δημιουργήθηκε με την τεχνική εκτύπωσης κεριού σε ένα χρωματογραφικό χαρτί. Η υδρόφιλη επιφάνεια καλύφθηκε με το τυχαίο συμπολυμερές πολυ(μεθακρυλικός μεθυλεστέρας)/πολυ(μεθακρυλικό οξύ) (PMMA-co-PMAA), ένα συμπολυμερές αποκρινόμενο στο pH. Για τον προσδιορισμό της κρεατινίνης, στην επιφάνεια του συμπολυμερούς ακινητοποιήθηκε το ένζυμο δεϊμινάση της κρεατινίνης (creatinine deiminase, CD). Τα αποτελέσματα έδειξαν, αφενός, μηδενική ροή του δείγματος ούρων στο τροποποιημένο με το PMMA-co-PMAA κάθετο κανάλι ροής, απουσία του ενζύμου CD (αυτό αποδεικνύει τη μεγάλη εκλεκτικότητα της μεθόδου έναντι των συστατικών της μήτρας του δείγματος), και αφετέρου, τη ροή του δείγματος στο κανάλι μετά την αποδόμηση του συμπολυμερούς που προκαλείται από την ενζυμικά παραγόμενη αμμωνία κατά την εκλεκτική υδρόλυση της κρεατινίνης παρουσία του ενζύμου. Για την κατασκευή του βιοαισθητήρα το τροποποιημένο με CD/PMMA-co-PMAA χαρτί συνδυάστηκε με τρεις αγώγιμες ταινίες σε μία συστοιχία που επιτρέπει την αυτόματη έναρξη και παύση της λειτουργίας του χρονομέτρου, κατά την προσθήκη του δείγματος και στο τέλος της μέτρησης, αντίστοιχα. Ο χρόνος αυτός αντιστοιχεί στο χρόνο αποδόμησης του συμπολυμερούς και είναι ανάλογος της συγκέντρωσης της κρεατινίνης. Το κύκλωμα αυτόματης έναρξης και παύσης της λειτουργίας του χρονομέτρου βασίζεται σε μετρήσεις της ηλεκτρικής αντίστασης μεταξύ των τριών αγώγιμων ταινιών. Ο βιοαισθητήρας περιλαμβάνει ένα εσωτερικό μικροφρεάτιο για το δείγμα και ασύρματη επικοινωνία μέσω ενός μικροεπεξεργαστή, με Bluetooth®, που ελέγχει δυο κυκλώματα μέτρησης χρόνου και αντίστασης. Χρησιμοποιώντας νέα συμπολυμερή PMΜA-co-PMAA σε διάφορα μέσα μοριακά βάρη κατά αριθμό (Μ̅n) και κλάσματα όγκου (f) μεταξύ των δυο μονομερών, τα οποία αποκρίνονται στο pH, επιτυγχάνονται ρυθμιζόμενες ιδιότητες αποδόμησης. Με την επιλογή του κατάλληλου συμπολυμερούς (f, Μ̅n και συγκέντρωση του συμπολυμερούς) το εύρος ανίχνευσης ρυθμίστηκε στα 3-30 mM κρεατινίνης, το οποίο καλύπτει το φυσιολογικό εύρος της κρεατινίνης στα ούρα. Η συσκευή χρησιμοποιήθηκε επιτυχώς για τον προσδιορισμό της κρεατινίνης στα ούρα. Στην τελευταία ενότητα περιγράφεται η ανάπτυξη ενός αισθητήρα για την ανίχνευση του Ελικοβακτηριδίου του πυλωρού σε βιοπτικά δείγματα στομάχου, εφαρμόζοντας την τεχνολογία BioPoC. Αξιοποιώντας το ένζυμο ουρεάση που παράγεται από το βακτήριο, αναπτύχθηκε ένας αισθητήρας απόκρισης στις μεταβολές του pH, παρουσία διαλύματος ουρίας. Πραγματοποιήθηκε μελέτη διαφόρων συμπολυμερών απόκρισης στο pH, για την ανάπτυξη ενός ευαίσθητου αισθητήρα που θα ανιχνεύει το H. Pylori, ακόμη και σε πρώιμα στάδια της μόλυνσης. Η ανάλυση των βιοπτικών δειγμάτων πραγματοποιήθηκε στο σημείο εξέτασης του ασθενή, παρέχοντας τα αποτελέσματα σε χρόνο μικρότερο από 30 λεπτά. Τα αποτελέσματα ήταν συγκρίσιμα με αυτά που λήφθηκαν με τις μεθόδους αναφοράς και βρέθηκε ότι ο αισθητήρας BioPoC έχει ειδικότητα 92% και ευαισθησία 83%. The development of medical diagnostic devices for point-of-care applications (PoC) is a key demand towards the establishment of decentralized health-care systems. The cost of miniaturized transducers, the need for elaborated modification of the sensing surface and the complexity of the assay workflow impede the widespread use of current biosensing technologies to PoC applications. In the first section, is described the development of a portable medical diagnostic device (we call it “BioPoC”), which employs free-standing enzyme-modified responsive polymer membrane-based biosensors and a newly devised low-cost transduction principle. The device includes a single vertical channel with an integrated sample dosing well. Its operation is based on the measurement of the time required the originally infinite electric resistance between two, separated by the enzyme-modified responsive polymer membrane, conductive strips to reach a finite value as a result of the target-triggered degradation of the polymer membrane and the ensuing vertical flow of the sample, which thus establishes an electrical communication between the conductive strips. The time is proportional to the concentration of the target. As part of the proof-of-concept, BioPoC device was employed for the determination of urea in undiluted human urine. By proper selection of the membrane thickness and concentration of copolymer, device operation was adjusted to the analyte concentration range in urine. Data demonstrate an outstanding selectivity against the components of the matrix, while the detection range can be tuned over the normal range of the analyte of interest. In the second section, a SIM card-type pH responsive polymer-modified paper-based biosensing device, coupled to a smartphone, for the determination of urinary creatinine was developed. A vertical microfluidic channel was fabricated on a paper strip by wax printing. The hydrophilic area was coated by a poly(methylmethacrylate)/ poly(methacrylic acid) random copolymer, PMMA-co-PMAA, and on top of it, creatinine deiminase (CD) was immobilized. Data demonstrated, on the one hand, zero vertical flow of urine through the enzyme-free PMMA-co-PMAA-modified paper strip, i.e., a high selectivity against the components of the matrix, and on the other hand, in the presence of CD, a creatinine -concentration dependent commence of sample’s downward flow due to the selective, creatinine-triggered degradation of the copolymer by the enzymatically produced ammonia. This CD/ PMMA-co-PMAA paper-based biosensing smart assembly is coupled with three conductive strips, which enable the automatic on/off (sample addition/measurement end) measurement of the copolymer degradation time, through electric resistance measurements. It also features an in-built sample well and wireless communication support through the integration of a Bluetooth® microprocessor incorporated with time and resistance measuring circuits. Using newly synthesized pH responsive PMMA-co-PMAA at different molecular weights and volume fraction ratios offering tunable dissolution properties, the detection range was adjusted over 3–30 mM creatinine to overspread the normal range of creatinine in urine. The device was successfully applied to the determination of urinary creatinine. In the last section, the development of a sensor for the detection of Helicobacter pylori, by applying the BioPoC technology, is described. Utilizing the enzyme urease produced by this bacterium, a sensor that responds to pH changes, in the presence of urea solution was developed. Various pH-responsive copolymers were examined to develop a sensitive sensor that would enable the detection H. Pylori, even at the early stages of infection. The examination of bioptic samples was performed at the patient's point of examination, providing results in less than 30 minutes. The results were comparable to those obtained by a commercial test (CLO) and the histologic examination. The specificity and the sensitivity of the BioPoC sensor were found to be 92% and 83%, respectively. Η παρούσα διδακτορική διατριβή υλοποιήθηκε στο πλαίσιο της Δράσης ΕΡΕΥΝΩ–ΔΗΜΙΟΥΡΓΩ-ΚΑΙΝΟΤΟΜΩ και συγχρηματοδοτήθηκε από την Ευρωπαϊκή Ένωση και εθνικούς πόρους μέσω του Ε.Π. Ανταγωνιστικότητα, Επιχειρηματικότητα & Καινοτομία (ΕΠΑνΕΚ) (κωδικός έργου:Τ1ΕΔΚ-03341) 151 σ.