Η γονιδιωματική εκδοτική επεξεργασία (genome editing) ως θεραπευτική προσέγγιση για τη μοριακή θεραπεία της β-θαλασσαιμίας
In: uoadl:1326251;; (2016)
Hochschulschrift
Zugriff:
Η β-θαλασσαιμία προκύπτει από διαταραχές στην παραγωγή της β-αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης λόγω μεταλλάξεων στο β-γονίδιο. Ωστόσο, επειδή είναι γνωστό ότι η έκφραση της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF, α2γ2) στους θαλασσαιμικούς ασθενείς βελτιώνει σημαντικά την κλινική τους εικόνα, η επανενεργοποίηση της έκφρασης των ενδογενών γ-γονιδίων με στοχευμένη και ελεγχόμενη γενετική απαλοιφή γνωστών και καλά χαρακτηρισμένων καταστολέων της έκφρασής τους θα αποτελούσε μια δυνητική θεραπευτική προσέγγιση. Προς τον σκοπό αυτό, ο στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας υπήρξε η επιλεκτική αφαίρεση από το γονιδίωμα συγκεκριμένων καταστολέων της γ-σφαιρίνης, όπως το πρωτο-ογκογονίδιο c-myb και το ERV-9 LTR ρετροϊικό στοιχείο που βρίσκεται στο 5’ άκρο του γενετικού τόπου της β-σφαιρίνης, καθώς και η δημιουργία ελλειμμάτων τύπου HPFH (γειτνίαση των HPFH-1 και HPFH-2 ενισχυτών στο γονίδιο της γ-σφαιρίνης), μέσω της τεχνολογίας CRISPR/Cas9. Σχεδιάστηκαν ειδικά RNAs-οδηγοί (guide RNAs), με το εργαλείο βιοπληροφορικής CRISPR Design, Feng Zhang lab, Massachusetts Institute of Technology (http://crispr.mit.edu/) και κλωνοποιήθηκαν σε πλασμιδιακό φορέα ως συνέχεια του γονιδίου που κωδικοποιεί την νουκλεάση Cas9 του Streptococcus pyogenes. Η ορθότητα της κλωνοποίησης των guide RNAs στα πλασμίδια ελέγχθηκε με αλληλούχιση κατά Sanger. Τα πλασμίδια εισήχθησαν με την τεχνική της πυρηνοδιάτρησης (nucleofection) στα αιμοποιητικά κύτταρα Κ562 και σε ανθρώπινα αρχέγονα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα CD34+ φυσιολογικών ατόμων και θαλασσαιμικών ασθενών. Τα κύτταρα, στη συνέχεια, διαφοροποιήθηκαν προς ερυθροειδικό φαινότυπο, προκειμένου να εκτιμηθεί το ποσοστό των κυττάρων που εξέφραζαν γ-σφαιρίνη με κυτταρομετρία ροής (FACS). Η απόδοση της πυρηνοδιάτρησης εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής και η αποτελεσματικότητα εισόδου της Cas9 νουκλεάσης στον πυρήνα για την πρόκληση των στοχευμένων δίκλωνων ρηγμάτων εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής και ανοσοφθορισμό. Η αποτελεσματικότητα διαμόλυνσης των κυττάρων με τη μέθοδο του nucleofection ήταν 13.99% (n=3) και ...
Titel: |
Η γονιδιωματική εκδοτική επεξεργασία (genome editing) ως θεραπευτική προσέγγιση για τη μοριακή θεραπεία της β-θαλασσαιμίας
|
---|---|
Autor/in / Beteiligte Person: | Πολυτίμη, Μπουντούνη ; Polytimi, Bountouni |
Link: | |
Quelle: | uoadl:1326251;; (2016) |
Veröffentlichung: | 2016 |
Medientyp: | Hochschulschrift |
Schlagwort: |
|
Sonstiges: |
|