台灣西南海域深海底泥Methanoculleus及Methanosarcina之純化與特性分析 ; Isolation and Characterization of Methanoculleus and Methanosarcina from deep sea marine sediment offshore SW of Taiwan

Taiwan is situated on the boundary separating the Eurasian plate to the west from the Philippine Sea Plate to the east. There were complex landforms from SW of Taiwan, such as ridges, mud volcanos, cold seeps and gas hydrate bearing regions. The isotopic data from Prof. Tsan-Yao Yang's lab was suggested that most of the methane produced in Taiwan methane hydrate potential area is biogenic origin. To explore the methanogens at methane seeps or hydrate habitats, sediment samples obtained from piston core at Tainan Ridge, Good Weather Ridge, 96 Mud Volcano and Deformation Front by ORI (Ocean Reasearch I) cruises were enriched anaerobically. After anaerobic enrichment and serial sub-transfer, Methanoculleus sp. S3Fa from 96 Mud Volcano Groups was purified and characterized by MS Mei-Fei Chen. The 16S rRNA sequence of strain S3Fa showed 99% similarity with deep sea gas hydrate isolate Methanoculleus submarinus. Similar isolation methods were used in this study, three strains CYW1, CYW2 and CYW3, were purified from Deformation Front, Tainan Ridge and Good Weather Ridge, respectively. The 16S rRNA sequence of three strains showed 99% similarity with Methanosarcina mazei Go1. The whole-cell protein profile of strain CYW1, CYW2 and CYW3 are identical with M. mazei N2M9705. The irregular cocci cells of Methanoclleus sp. CYW4 was isolated from Defromation Front and showed 96-97% similarity with genus Methanoculleus. Strain CYW4 used H2 plus CO2 or formate as catabolic substrates. The optimum growth condition was 37°C, pH 8.02 and 0.08 M NaCl. The result showed that strain CYW4 was the novel new species and might be the new clade in genus Methanoculleus. It is expected that these methanogens isolated from methane seep and gas hydrate potential bearing regions contribute to the methane hydrate formation. ; 台灣受到菲律賓海板塊及歐亞大陸板塊擠壓碰撞，造成廣大的增積岩體與台灣造山帶，使得台灣西南海域地形結構含有海脊、海底泥火山、冷泉、甲烷水合物賦存區等特殊地理環境。台大地質系楊燦堯教授實驗室以同位素研究顯示甲烷大多屬於生物性來源，應是甲烷太古生物甲烷化作用的產物。為了瞭解海洋底泥或甲烷水合物區的甲烷太古生物多樣性，藉由分離純化甲烷太古生物並與已知序列做比較分析，以探討台灣西南海域的甲烷太古生物相。2008-2011年間，以海洋研究船(Ocean Reasearch I, ORI)於台南海脊、好景海脊、96泥火山群及變形前緣區取出活塞岩心樣品。經過增殖培養及連續稀釋法後，陳眉霏碩士在96泥火山群分離純化出Methanoculleus sp. S3Fa，經由親緣關係比對，發現與天然氣水合物棲地純化的Methanoculleus submarinus有99%相似度。本研究以類似的增殖方法，分別自變形前緣區、台南海脊及好景海脊的活塞岩心底泥樣品純化出Methanosarcina mazei CYW1、CYW2及CYW3，經由親緣關係比對，菌株CYW1、CYW2及CYW3與Methanosarcina mazei Go1有99-100%相似度，能利用甲醇為碳源，且在全細胞蛋白質分析表現與M. mazei N2M9705非常相近。自變形前緣區的活塞岩心底泥樣品純化出Methanoculleus sp. CYW4，菌株CYW4與Methanoculleus屬有96-97%相似度，在生理特性分析方面，能利用甲酸及H2/CO2為甲烷生成之基質，最適生長溫度、鹽度及pH分別為37°C、0.08 M及pH 8.02，為新型的甲烷太古生物。M. mazei廣泛存在於各種環境中，可能在各種環境有良好的適應能力。由於處於特殊地理環境，菌株CYW4在Methanoculleus菌群當中獨立於另一分支，這些結果顯示已純化的甲烷菌株在台灣西南海域中對甲烷生成扮演著重要地位，進一步了解台灣西南海域海底底泥可能參與甲烷生成的甲烷太古生物，並可增加微生物資料庫，對於未來甲烷水合物的開採利用及甲烷資源的開發值得更進一步探討。 ; 中文摘要 i 英文摘要 ii 目錄 iii 表目錄 vii 圖目錄 viii 壹、前言 1 貳、前人研究 3 一、 海洋環境與微生物 3 (一) 細菌(Bacteria) 3 (二) 太古生物(Archaea) 4 二、 ¬海底環境之甲烷水合物 6 三、 甲烷為主的生態系 7 (一) 冷泉(cold seep)及甲烷水合物(methane hydrate) 8 (二) 海底泥火山 9 四、 甲烷太古生物 (Methanogen) 10 (一)甲烷太古生物分類 10 1. Order Methanosarcinales 11 2. Order Methanobacteriales 11 3. Order Methanococcales 12 4. Order Methanomicrobiales 12 5. Order Methanocellales 12 6. Order Methanopyrales 13 7. Order 'Methanoplasmatales' 13 (二) 台灣本土甲烷太古生物 14 (三) 甲烷太古生物對環境及人類的影響與應用 16 五、 台灣西南海域相關研究成果 18 (一) 96泥火山群(96 Mud Volcano Groups) 18 (二) 變形前緣區(Deformation Front) 19 (三) 好景海脊(Good Weather Ridge) 19 (四) 台南海脊(Tainan Ridge) 20 (五) 台灣西南海域甲烷太古生物收集成果 20 六、 研究目的與策略 21 參、材料與方法 22 一、採樣時間與地點 22 二、藥劑與培養基 22 (一)除氧操作系統(Hungate station) 22 (二)MB/W及MM/W medium配製 22 (三)還原劑與碳源製備 23 (四)抗生素溶液製備 24 (五)TGC (thioglycollate) 培養基 24 三、甲烷菌増殖(enrichment)培養與厭氧轉殖接種 25 (一)接菌 25 (二)氣相層析儀偵測樣本甲烷氣體 25 (三)連續稀釋 25 (四)Roll tube方法 26 (五)抗生素添加 26 四、Roll tube菌株篩選 26 (一)厭氧操作箱(Coy chamber) 26 (二)挑取roll tube內菌落 27 五、微生物形態觀察 27 (一)位相差顯微鏡觀察細胞形態 27 (二)穿透式電子顯微鏡經負染方式觀察細胞形態 27 (三)場發射掃描電子顯微鏡觀察細胞 28 六、生長與生理生化特性分析 28 (一)甲烷太古生物於不同濃度Na2S之測試 28 (二)甲烷太古生物使用基質的配製與測試 29 (三)不同NaCl濃度厭氧培養液MB/W的配製與測試 29 (四)不同酸鹼值的厭氧培養液MB/W的配製與測試 29 (五)溫度生長範圍測試 30 (六)生長曲線的測定 30 (七)SDS感受性測試 31 (八)抗生素抗性測試 31 七、甲烷太古生物染色體DNA萃取 31 八、核酸純度與定量分析 32 九、核酸電泳分析 32 十、聚合酶連鎖反應(PCR) 33 十一、PCR增幅樣品濃縮 33 十二、DNA接合反應 34 十三、勝任細胞的製備與質體轉形作用 34 (一)勝任細胞的製備 34 (二)質體轉形作用 35 十四、質體抽取與純化 35 十五、核酸定序與序列分析 36 十六、DNA G+C含量檢測 36 十七、全細胞蛋白樣品之製備 37 十八、表面蛋白(Surface layer)之製備 37 十九、蛋白質電泳分析 (SDS-PAGE) 38 肆、結果與討論 39 一、深海底泥甲烷太古生物之增殖培養與純化 39 二、自海洋變形前緣區純化的Methanoculleus sp. CYW4之形態生理生化特性 分析與系統演化分類 40 (一) 細胞形態 41 (二) 16S rRNA基因序列與系統演化分析 42 (三) Methanoculleus sp. CYW4 G+C含量 42 (四) Methanoculleus sp. CYW4在MB/W培養基之生長形態 43 (五) 生理生化與生長特性分析 43 (六) 抗生素抗性分析 44 (七) Surface layer分析 45 (八) 台灣西南海域變形前緣區之Methanoculleus sp. CYW4 45 三、自海洋變形前緣區、台南海脊及好景海脊純化的甲烷太古生物 Methanosarcina mazei CYW1、CYW2及CYW3形態生理生化特性分析與 系統演化分類 46 (一) 細胞形態 47 (二) 16S rRNA基因序列與系統演化分析 47 (三) 生長溫度特性分析 48 (四) 全細胞蛋白分析 48 (五) 台灣西南海域之Methansarcina mazei 48 伍、結論 50 陸、表與圖 51 柒、參考文獻 72 捌、附錄 87