Ein Mausmodell für die fehlende Erkennung methylierter DNA durch das Mbd1-Protein (Methyl-CpG-bindendes Protein 1)

DNA-Methylierung in der Dinukleotidsequenz CpG ist von entscheidender Bedeutung bei der Inaktivierung eines der beiden X-Chromosomen in weiblichen Säugetierzellen, bei der allelspezifischen Genexpression (Imprinting) und bei der Inaktivierung von repetitiven genomischen Elementen (Retrotransposons und endogenen Retroviren). Weiterhin ist DNA-Methylierung essentiell für die Entwicklung von Säugetieren und deren Genregulation. Bevorzugt im Heterochromatin lokalisiertes Methyl-CpG-bindendes Protein 1 (MBD1) gehört einer Familie von Methyl-CpG bindenden Proteinen mit den Mitgliedern MeCP2, MBD1, MBD2, MBD3 und MBD4 an, die das Methylierungsmuster der DNA interpretieren. Frühere Analysen defizienter Mäuse zeigen, dass Methyl-CpG-bindende Proteine die Tumorgenese beeinflussen und durch die Interaktion mit histonmodifizierenden Proteinen die Genexpression in vivo steuern. Murines Mbd1 enthält mehrere funktionelle Domänen und kommt in vier Splicevarianten vor; die Volle-Längen-Variante v1 enthält 636 Aminosäuren. Der Methyl-CpG-Bindungsdomäne folgen ein Kernlokalisierungssignal, dann drei cysteinreiche CXXC-Domänen, welche eine unspezifische DNA-Bindung bewirken, und schließlich C-terminal eine transkriptionelle Repressordomäne. Um die Funktion von MBD1 in vivo zu charakterisieren, wurden konditional MBD1-defiziente Mäuse mit getargeten Allelen und MBD1-defiziente (MBD1-Knockout) Mäuse generiert. Für die letzteren Mäuse wurde Exon 2, welches das Startcodon enthält und etwa die Hälfte der Methyl-CpG-Bindungsdomäne kodiert, deletiert. Bei den Mäusen mit getargetem Allel wurde die Möglichkeit einer embryonal letal wirkenden Defizients berücksichtigt und somit ein konditionaler Ansatz verfolgt. Zu Anfang klonierte ich einen Targeting-Vektor, der einen kurzen und einen langen Arm mit genomischer Mbd1-Sequenz enthält, welche durch das Neomycin-resistenz-Gen und drei loxP-Stellen unterbrochen sind. Nach Elektroporation des linearisierten Vektors in murine ES-Zellen wurden Klone selektioniert, in denen der Vektor mit dem Mbd1-Locus homolog rekombinierte und ein getargetes Allel entstand. Korrekte Klone wurden mittels Southernblot- und PCR-Analysen identifiziert. Zwei Klone wurden in Blastozysten injiziert und in scheinschwangere Mäuse implantiert. Resultierende chimäre Mäuse wurden mit Wild-typmäusen gekreuzt, um heterozygote Tiere zu erhalten. Für die Generierung der MBD1-defizienten Mäuse wurden ES-Zellen mit getargetem Allel mit einem Cre-exprimierenden Plasmid transient transfiziert. Klone mit deletiertem Exon 2 wurden mittels Southernblot- und PCR-Analysen identifiziert. Wiederum wurden zwei Klone in Blastozysten injiziert und in scheinschwangere Mäuse implantiert. Hieraus entstanden neun chimäre Tiere, die ebenfalls mit Wildtypmäusen rückgekreuzt wurden. Alle genetischen Manipulationen waren keimbahngängig. Insgesamt wurden somit vier Mauslinien erhalten, zwei konditional MBD1-defiziente Linien mit getargetem Allel und zwei MBD1-defiziente Linien. Die konditional MBD1-defizienten Mäuse mit getargetem Allel zeigten eine verringerte Expression des Mbd1-Gens, aber relativ zu Wildtypmäusen eine unveränderte Mbd1-Protein-Expression in Lebergewebe. Die MBD1-defiziente Mäuse waren lebensfähig und fertil. Interessanterweise war die Häufigkeit homozygoter weiblicher MBD1-defizienten Nachkommen relativ zu derjenigen heterozygoter und Wildtyp-Geschwisterweibchen reduziert; mögliche Ursachen werden diskutiert. Ein Analyseschwerpunkt der MBD1-defizienten Mäuse war das Herz. Das relative Herzgewicht aller MBD1-defizienten Mäuse zusammengenommen entsprach dem der Wildtypmäuse. Jedoch war das relative Herzgewicht in der Subpopulation der 12 bis 16 Wochen alten MBD1-defizienten Weibchen um 21,0% ± SEM 0,42 (p<0,05) erhöht. Verschiedene andere Parameter des Herzens waren allerdings unverändert. Ebenso unverändert war die Expression einer Reihe von Imprinting- und Tumorsuppressorgenen in Hirn und Herz, u.a. die Expression des Imprintinggens Snrpn. Dies war unerwartet, da frühere Chromatin-Immunpräzipitationen zeigten, dass MBD1 mit dem Snrpn-Gen assoziiert ist. Weiterführende Untersuchungen mit den konditional MBD1-defizienten sowie MBD1-defizienten Mäusen sollten zu einem besseren Verständnis der epigenetischen Mechanismen beitragen, wie die Interpretation des DNA-Methylierungsmusters zu veränderten Chromatinmodifikationen und Genexpressionen führt.

DNA methylation at CpG dinucleotides is crucial for silencing of one of the two X chromosomes in mammalian cells, for imprinting and for inactivation of repetitive elements (retrotransposons and endogenous retroviruses). Furthermore, DNA methylation is essential for mammalian development and for regulating mammalian gene expression. Methyl-CpG-binding protein 1 (MBD1), which preferentially localizes in heterochromatin regions, belongs to the family of methyl-CpG-binding proteins comprising the members MeCP2, MBD1, MBD2, MBD3 and MBD4, which interpret the DNA methylation pattern. Previous mice deficient in one of these proteins show that methyl-CpG-binding proteins influence tumorigenesis and regulate gene expression in vivo through interaction with histone modifying proteins. Murine Mbd1 harbors several functional domains and occurs in four spice variants; the full-length variant v1 contains 636 amino acids. The methyl-CpG-binding domain is followed by a nuclear localization signal, three cystein-rich CXXC domains, which mediate unspecific DNA binding, and a C-terminal transcriptional repression domain. To characterize the function of Mbd1 in vivo, I generated conditional MBD1-deficient mice with targeted allels and MBD1-deficient (MBD1-knockout) mice. In the latter mice exon 2, which contains the start codon and encodes half of the methyl-CpG-binding domain, is deleted. The mice with targeted allels were generated in order to be used in case that MBD1-deficient mice would have been embryonically lethal. In the beginning I cloned a targeting vector which contains a short and a long arm with genomic Mbd1 sequences interrupted by the neomycin resistence gene and three lox-P-sites. After electroporation of the linearized vector into murine embryonic stem cells I screened stem cell clones in which the vector underwent homologous recombination with the Mbd1-gene to generate a targeted allel. Correct clones were identified by Southern blotting and PCR-analyses. Two clones were injected into blastocysts and implanted into pseudopregnant mice. Resulting chimeric mice were crossed with wild type mice to obtain heterozygous conditional MBD1-deficient mice with a targeted allel. To generate MBD1- deficient mice, stem cells with a targeted allel were transfected with a Cre-expressing plasmid. Clones with deleted exon 2 were identified by Southern blotting and PCR analyses. Again two clones were injected into blastocytes and implanted into pseudo pregnant mice. Nine resulting chimeric mice were back-crossed with wild type mice. All genetic manipulations had germline transmission. Totally, I generated four mouse lines, two conditional MBD1-deficient lines with targeted allels and two MBD1-deficient lines. Conditional MBD1-deficient mice with targeted allels show reduced expression of the Mbd1- gene, but – relative to wild type mice – an unchanged Mbd1 protein expression. MBD1-deficient mice were viable and fertile. Interestingly, the frequency of homozygous female MBD1-deficient mice were reduced relative to that of heterozygous and wildtype sister females; possible causes are discussed. I focussed on analyses of various heart functions of the MBD1-deficient animals. The relative heart weight of all MBD1-deficient mice corresponded to that of wild type mice. However, the relative heart weight in the subgroup of 12 to 16 weeks old MBD1-deficient mice was elevated by 21,0% ± SEM 0,42 (p< 0.05). Yet various other parameters of the heart were unaltered. Also expression of various imprinting and tumor suppressor genes in brain and heart were unchanged, including expression of the imprinting gene Snrpn. This was unexpected since previous chromatin immunoprecipitation analyses showed that MBD1 is associated with the Snrpn gene. Further studies using the conditional MBD1-deficient mice as well as the MBD1-deficient mice should lead to a better understanding of the epigenetic mechanisms of how interpretation of the DNA methylation pattern directs modified chromatin structures and altered gene expression.