Molekulare Analyse der CD83 Expression humaner Leukozyten : Molecular Dissection of CD83 Expression in Human Leukocytes

Der Austausch von Molekülen zwischen Zellkern und Zytoplasma ist ein lebenswichtiger Mechanismus eukaryotischer Zellen, der direkt die Regulation der Genexpression beeinflusst. Diese Regulation erfolgt dabei auf verschiedenen Ebenen, wie beispielsweise der Transkription, der Translation oder den posttranskriptionellen Prozessierungsmechanismen von mRNA. Der nukleozytoplasmatische Export von mRNAs wird hierbei der posttranskriptionellen Prozessierung von mRNA zugerechnet. Dabei galt lange Zeit das Dogma, dass zelluläre mRNAs über das Heterodimer TAP-p15 vom Zellkern ins Zytoplasma transportiert werden. Inzwischen zeigte sich aber, dass bestimmte Gruppen induzierbarer zellulärer mRNAs unerwarteterweise über das Karyopherin CRM1 ins Zytoplasma translozieren. So wird beispielsweise der nukleozytoplasmatische Transport von Transkripten sogenannter early response genes CRM1-abhängig vermittelt. Doch auch mRNAs immunrelevanter Proteine wie das Transkript des Glykoproteins CD83 konnten unlängst als CRM1-abhängig identifiziert werden. Von CD83 wird vermutet, dass es bei der Aktivierung der zellulären T-Zellantwort eine wichtige Rolle spielt und unter anderem von reifen Dendritischen Zellen exprimiert wird. Weitere zelluläre Komponenten des CRM1-abhängigen CD83 mRNA-Transports wurden kürzlich identifiziert: Das RNA-Bindeprotein HuR, welches mit einem cis-aktiven posttranscriptional regulatory element (PRE) in der kodierenden Region CD83 mRNA interagiert, sowie das Phosphoprotein APRIL, welches als Adaptorprotein den HuR:CD83 mRNA Komplex mit dem CRM1-Rezeptor verknüpft. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte detaillierte Analyse dieser beiden Komponenten HuR und APRIL in der vorliegenden Arbeit lieferte neue Einblicke hinsichtlich ihrer Interaktion und Regulation im CRM1-abhängigen CD83 mRNA-Kernexport. So konnte bezüglich der Spezifität der Bindung von HuR an das cis-aktive PRE der CD83 mRNA gezeigt werden, dass es sich hierbei um eine struktur- und nicht um eine sequenzspezifische Interaktion handelt. Des Weiteren machte die ausführliche Charakterisierung des Phosphorproteins APRIL deutlich, dass es sich bei diesem Protein um einen wichtigen Regulator der Genexpression von CD83 handelt. Neben der bereits bekannten Phosphatakzeptorstelle T244 von APRIL konnten mit S158 und S210 zwei weitere Phosphorylierungsstellen identifiziert werden. Dabei zeigte sich, dass nicht nur die Modifikation an T244, sondern auch an S210 für die nukleozytoplasmatische Translokation des Proteins eine wichtige Rolle spielt. Interessanterweise wird die posttranslationale Modifikation aller drei APRIL-Phosphatakzeptorstellen durch die Casein Kinase 2 (CK2) vermittelt, einer pleiotropen Kinase, die eine Vielzahl zellulärer Mechanismen reguliert. Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden konnte, erfolgt die Regulation der CD83 Expression über die Untereinheit α‘ der CK2. Des Weiteren konnte erstmalig eine direkte Korrelation zwischen der CD83 und APRIL Expression im komplexen und lebensnahen Zellsystem primärer Dendritischer Zellen dargestellt werden. Zudem hat die erfolgreiche Konstruktion transgener Mäuse, die ein gefloxtes APRIL-Gen tragen, die Grundlage für zukünftige Studien im Tiermodell geschaffen. Diese transgene Mauslinie ermöglicht für weiterführende Arbeiten eine gewebsspezifische und/oder induzierbare Deletion von APRIL, so dass zukünftig weitere wichtige Erkenntnisse bezüglich der Funktion von APRIL für die Genexpression von CD83, aber auch für weitere CRM1-abhängige Transkripte im Gesamtorganismus erlangt werden können. Die umfangreiche Analyse der zellulären Proteine HuR und APRIL im Rahmen dieser Arbeit hat neue Werkzeuge und Erklärungsansätze hinsichtlich des CRM1-abhängigen CD83 mRNA-Exports geschaffen, so dass die CRM1-abhängige CD83 mRNA-Exportmaschinerie als Modellmechanismus für den Transport zellulärer CRM1-abhängiger mRNAs betrachtet werden kann.

The exchange of molecules between the nucleus and the cytoplasm is an essential mechanism in eukaryotic cells that affects the regulation of gene expression. This regulation occurs at various levels, such as transcription, translation or posttranscriptional processing of mRNA. Here, the nucleocytoplasmic export of mRNA is considered to be part of its posttranscriptional processing. The dogma that the vast majority of cellular mRNAs is exported from the nucleus to the cytoplasm by the heterodimer TAP- p15 has existed for a long time. However, in the last few years several subpopulations of cellular mRNAs have been identified that translocate from the nucleus to the cytoplasm in a CRM1-dependent manner. Until these findings, the karyopherin CRM1 was primarily known as an export receptor for proteins, ribosomal and small nuclear RNAs, and unspliced viral transcripts. Interestingly, CRM1-dependent mRNAs are generally transcribed from inducible genes, such as early response genes. Moreover, CRM1-dependent transcripts, such as the the transcript encoding the glycoprotein CD83, were also detected in a subpopulation of immune relevant mRNAs in activated Jurkat T cells. CD83 is a surface molecule mainly expressed on fully matured dendritic cells and appears to play a role in T cell activation. Recently, additional cellular components of the CRM1-dependent CD83 mRNA export machinery have been identified: the RNA-binding protein HuR, interacting with a cis-active posttranscriptional regulatory element (PRE) within the coding region of the CD83 mRNA, and the phosphoprotein APRIL, acting as an adaptor connecting the HuR:mRNA complex and CRM1. In the present thesis, novel insights into the function of HuR and APRIL during CRM1-dependent CD83 gene expression have been provided. Investigating the specificity between the RNA binding protein HuR and the cis-active PRE of the CD83 mRNA elucidated a structure-dependent, but not sequence-specific interaction within the HuR:CD83 mRNA complex. Furthermore, the functional characterization of the phosphoprotein APRIL revealed its functional importance for CD83 gene expression. Identification of two novel phosphate acceptor sites – S158 and S210 – demonstrated that not only the already known T244 phosphorylation site, but also S210 is relevant for nucleocytoplasmic shuttling of APRIL. Interestingly, all three phosphate acceptor sites are posttranslationally modified by the pleiotropic kinase CK2, which is known to regulate a multitude of cellular mechanisms. The present work furthermore demonstrated that the regulation of CD83 expression particularly depends on the α’ subunit of CK2. Moreover and for the first time, a direct correlation between CD83 and APRIL expression was demonstrated in primary dendritic cells. Finally, the successful construction of transgenic mice with targeted mutations of a floxed APRIL-gene established the basic technology for future studies. This transgenic strain facilitates inducible and/or tissue specific deletions of APRIL to not only investigate its role in CD83 gene expression but also for further CRM1-dependent mRNAs in an animal mode. The detailed analysis of the cellular proteins HuR and APRIL in the regulation of the CRM1-dependent CD83 expression provides new insights into the nuclear export of CD83 mRNA. Furthermore, the results of this thesis suggest that CD83 mRNA export may serve as a model mechanism for the investigation of cellular CRM1-dependent mRNAs in general.