Disease modelling and molecular therapy of severe cardiomyopathy in hiPSC-derived cardiomyocytes carrying bi-allelic truncating MYBPC3 mutations

Cardiomyopathies are cardiac genetic diseases, leading to heart failure and sudden cardiac death even among young people. One of the most important genes affected is the MYBPC3 gene, encoding cardiac myosin-binding protein-C (cMyBP-C). Bi-allelic truncating mutations - homozygous or compound heterozygous - are very severe and cause death of infants in the first year of life. Up to now there is no disease curing treatment other than heart transplant. Therefore, the aim of this thesis was to analyse the effect of bi-allelic truncating MYBPC3 mutations, which mimic the genetic of infants with a severe course of disease, in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) in 2D and 3D engineered heart tissues (EHTs) and test MYBPC3 gene replacement therapy. HiPSCs (CMS32) were reprogrammed from a female patient with hypertrophic cardiomyopathy (HCM) who carried a heterozygous mutation in MYBPC3 (c.2308G>A). The mutation is located on the last nucleotide of exon 23, which belongs to the highly conserved 5’ donor splice site sequence. Consequently, it is considered as a truncating mutation. To detect the nonsense mRNA, CMS32-hiPSCs were differentiated into cardiomyocytes (CMs) and treated with drugs inhibiting the nonsense-mediated mRNA decay (NMD), which stabilised the nonsense mRNA that is normally degraded by this safety control mechanism. Sequencing identified a nonsense mRNA with a 298-bp retention of intron 23 and therefore a frameshift followed by a premature termination codon (PTC; Asp770Serfs98X). Furthermore, the CMS32 cell line was used to repair the existing mutation (isogenic control) and to introduce a Dutch founder mutation (c.2827C>T, p.Arg943X) with the CRISPR/Cas9 genome editing to mimic the genetic situation of the affected children (bi-allelic truncating mutant). Sequencing revealed that 6/41 CRISPR clones were corrected and 6/93 CRISPR clones harboured the second mutation in heterozygous or homozygous state. Four of the repaired cell lines were expanded to a master cell bank (MCB) as well as one bi-allelic clone with homozygous founder mutation. The MCBs were checked for hiPSC quality markers and for the absence of the top 10 in silico predicted off-targets. HiPSC lines were then differentiated into CMs for further experiments. Analysis on protein level by Western blot validated the functional cMyBP-C knock-out in the bi-allelic mutant hiPSC-CMs. Besides, truncated cMyBP-C was not detected, neither in the bi-allelic mutant nor in CMS32-CMs. In the latter, cMyBP-C levels were lower (30.6%) than in the isogenic control. Furthermore, functional analysis in EHTs revealed a markedly lower force development and a higher beating frequency in the bi-allelic mutant than in the other genotypes. In addition, β-adrenergic stimulation with isoprenaline did not lead to full recovery of force (inotropic response) and frequency (chronotropic response) in bi-allelic mutant in contrast to the heterozygous mutant and repaired EHTs. Finally, the three hiPSC-CM lines were transduced (multiplicity of infection: 10,000) with an adeno-associated virus serotype 6 carrying the wild-type MYBPC3 cDNA as gene therapy to replace the missing protein as haploinsufficiency was considered the disease mechanism. Qualitative PCR, Western blot and immunofluorescence analysis showed that exogenous MYBPC3 is expressed, and cMyBP-C protein is well incorporated in transduced cells and led to a reduction of cell size in the heterozygous state, which provided proof-of-principle of gene replacement therapy in hiPSC-CMs in vitro.

Kardiomyopathien sind genetische Herzerkrankungen, die zu Herzinsuffizienz und plötzlichem Herztod bei jungen Menschen führen können. Eines der wichtigsten beteiligten Gene ist das MYBPC3-Gen, welches für das kardiale Myosin-bindende Protein C (cMyBP-C) kodiert. Biallelische trunkierende Mutationen - homozygot oder komplex heterozygot - sind besonders schwerwiegend und führen innerhalb des ersten Lebensjahres zum Tod der betroffenen Kinder. Bisher gibt es keine kausale Therapie außer der Herztransplantation. Daher war es das Ziel dieser Doktorarbeit, die Auswirkung von biallelischen trunkierenden MYBPC3-Mutationen, welche die Genetik der Kinder mit schwerem Krankheitsverlauf modellieren, in humanen induzierten pluripotenten Stammzell (hiPSC)-abgeleiteten Kardiomyozyten in 2D-Zellkultur und 3D künstlichen Herzgeweben (EHTs) zu untersuchen und eine MYBPC3-Genersatztherapie zu testen. Die humanen iPSCs (CMS32) stammten von einer Patientin mit hypertropher Kardiomyopathie, bei der eine heterozygote Genmutation im MYBPC3-Gen (c.2308G>A) festgestellt wurde. Diese Mutation liegt auf dem letzten Nukleotid des Exons 23, welches zur hoch konservierten 5‘ Donor-Spleißstellen-Sequenz gehört. Infolgedessen wird es für eine trunkierende Mutation gehalten. Um die Nonsense-mRNA nachzuweisen, wurden die CMS32-hiPSCs zu Kardiomyozyten differenziert und mit pharmakologischen Substanzen behandelt, welche den Nonsense-vermittelten mRNA Abbau (NMD) inhibieren. Hierdurch wurde die Nonsense-mRNA stabilisiert, die normalerweise von diesem Sicherheits-Kontrollmechanismus abgebaut wird. Durch Sequenzierung konnte daraufhin eine Nonsense-mRNA mit einer 298 bp-langen Retention von Intron 23 identifiziert werden. Diese führte zu einem Frameshift gefolgt von einem vorzeitigen Stopcodon (Asp770Serfs98X). Darüber hinaus wurde die CMS32-Zelllinie dazu genutzt, die vorliegende Mutation mit Hilfe der CRISPR/Cas9 Geneditierungsmethode zu reparieren (isogene Kontrolle) sowie eine niederländische Gründermutation (c.2827C>T, p.Arg943X) einzubringen, um die genetische Situation betroffener Kinder nachzuahmen (biallelisch trunkierend). In der Sequenzierung zeigte sich, dass 6 von 41 CRISPR-Klonen repariert wurden und 6 von 93 CRISPR-Klonen die zweite Mutation heterozygot oder homozygot beinhalteten. Vier der reparierten Zellklone sowie ein biallelischer Klon mit der homozygoten Gründermutation wurden zu einer Master-Zell-Bank (MCB) expandiert. Die MCBs wurden auf hiPSC-Qualitätskriterien hin geprüft und die Top 10 der in silico-ermittelten Off-targets wurden ausgeschlossen. Die hiPSC-Linien wurden daraufhin für weitere Experimente zu Kardiomyozyten differenziert. Die Analyse auf Proteinebene mittels Western Blot bestätigte den funktionellen cMyBP-C-Knockout in den biallelisch mutierten hiPSC-CMs. Des Weiteren zeigte sich, dass trunkiertes cMyBP-C weder in der biallelisch mutierten Zelllinie noch in der CMS32-Zelllinie gefunden werden konnte. In letzterer waren die cMyBP-C-Spiegel geringer (30,6%) als in der isogenen Kontrolle. Ferner zeigte sich in der funktionellen Analyse der EHTs eine deutlich geringere Kraftentwicklung und eine höhere Schlagfrequenz in der biallelisch mutierten Zelllinie als in den anderen Genotypen. Im Gegensatz zu den heterozygoten und reparierten EHTs führte eine β-adrenerge Stimulation mit Isoprenalin nicht zu einer vollständigen Wiederherstellung der Kraft (inotroper Effekt) und Frequenz (chronotroper Effekt) in den biallelisch mutierten EHTs. Zu guter Letzt wurden die drei hiPSC-Kardiomyozytenlinien mit einem Adeno-assoziierten Virus des Serotyps 6 transduziert (Multiplizität der Infektion: 10.000). Dieser trug die Wildtyp MYBPC3-cDNA-Sequenz, um als Gentherapie das fehlende Protein zu ersetzen, da Haploinsuffizienz als ursächlicher Krankheitsmechanismus anzusehen war. Eine qualitative Polymerase-Kettenreaktion, Western Blot sowie eine Immunfluoreszenz-Analyse zeigten, dass das exogene MYBPC3 in den transduzierten Zellen exprimiert und cMyBP-C korrekt eingebaut wurde und zu einer Reduktion der Zellgröße in den heterozygoten Kardiomyozyten führte. Damit konnte der Nachweis hinsichtlich der prinzipiellen Durchführbarkeit der Genersatztherapie in hiPSC Kardiomyozyten in vitro erbracht werden.