Modeling primary carnitine deficiency-mediated dilated cardiomyopathy in engineered heart tissue format : Modellierung der durch einen primären Carnitinmangel verursachten dilatativen Kardiomyopathie in einem künstlichen Herzgewebeformat

Primary carnitine deficiency (PCD) is an autosomal recessive monogenic disorder caused by mutations in the gene SLC22A5, encoding for the plasmalemmal carnitine transporter OCTN2. PCD patients suffer from muscular weakness and dilated cardiomyopathy (DCM) due to reduced cellular carnitine uptake and require life-long oral L-carnitine supplementation. However, the initial disease mechanism of PCD is not clear, and predictive PCD in vitro models are required. Two principal mechanisms are considered relevant: (i) Impaired mitochondrial import of acylcarnitine leads to mitochondrial energy deprivation and (ii) reduced fatty acid metabolism results in cytoplasmic acyl-CoA accumulation, ceramide formation and lipotoxicity. To better characterize the molecular mechanism of PCD, CRISPR/Cas9 gene editing was used to generate hiPSC lines carrying a full OCTN2-knockout (OCTN2 (-/-)) and a homozygous point mutation (OCTN2 (N32S)) which is one of the most frequent OCTN2 mutations in PCD patients. The effect of the OCTN2 genotype on contractile force, proteome, single nuclear transcriptom and ultrastructural morphology was analyzed in a three-dimensional engineered heart tissue (EHT) model. In analogy to oral carnitine supplementation in PCD patients, the effect of carnitine media supplementation (2 mM) on contractile parameters and acylcarnitine and ceramide tissue content was studied. OCTN2-defective genotypes exhibited lower cardiac differentiation efficiency (cardiomyocyte output over hiPSC input), but no difference in cardiomyocyte purity, demonstrated by a high percentage of cTNT positive cells. OCTN2 (-/-) EHTs displayed lower force and resting length and higher contraction time under baseline conditions. While a similar trend was also observed for OCTN2 (N32S), this was not statistically significant due to high data scatter and smaller effect size. Unlike the isogenic control, force generation of both OCTN2 defective EHTs showed a positive correlation with cardiomyocyte purity (% of cTNT-positive cells), implicating a strong impact of non-cardiomyocytes on the disease phenotype in this model. Apart from contractile readouts, OCTN2-defective EHTs showed molecular alterations which resembled characteristics of PCD animal models such as myocardial lipid droplet accumulation, higher glucose uptake and compensatory upregulation of proteins involved in the carnitine shuttle system. Further defects in mitochondrial metabolism were demonstrated by lower mitochondrial DNA abundance, degraded mitochondrial morphology and indirectly by a decline in force development in fatty acid medium. TMT-based proteomic analysis identified a lower abundance of proteins involved in glycolysis, pyruvate metabolism and dysregulation of proteins related to TCA-cycle and oxidative phosphorylation. Impairment of pyruvate metabolism was supported by upregulation of pyruvate dehydrogenase kinase 4 (PDK4) on mRNA level, reproducing an alteration described in the heart of a PCD animal model. A higher abundance of extracellular matrix- and fibrosis-related proteins implicated the relevance of fibroblasts in this model, which was further supported by the strong representation of an activated fibroblast cluster in OCTN2-defective EHTs in single-nucleus RNA sequencing. O-linked glycosylation, a pathway recently described in the context of cardiac hypertrophy, was identified in the proteomic analysis as a mechanism that potentially contributes to metabolic remodeling in PCD. Moreover, ferroptosis was identified as a novel pathway in OCTN2-defective genotypes. This pathway describes an iron- and lipid-dependent cell death mechanism and linked the impairment of acylcarnitine metabolism with lipotoxicity. Carnitine media supplementation normalized acylcarnitine tissue contents and PDK4 transcript levels to isogenic control values and reduced lipid droplet accumulation and glucose consumption per cardiac workload. However, this intervention had only a minor effect on force development, and resting length and could not significantly decrease COL1A1 mRNA expression in OCTN2 (N32S) EHTs, suggesting that the supplementation was ineffective in preventing all aspects of the disease phenotype. Single-nuclear RNA sequencing revealed different clustering of cardiomyocyte subpopulations between isogenic control and OCTN2-defective EHTs with a higher expression of metabolic relevant regulators such as FOXO1 and ESR1 in the disease lines. Non-cardiomyocyte clusters like fibroblasts, endothelial cells and endocardium-like cells were enriched in OCTN2 defective EHTs. Additionally, the stronger representation of a leukocyte cluster in OCTN2-defective EHTs was compatible with a higher myeloid differentiation propensity of mesodermal progenitors. Taken together, this study established a human in vitro model for PCD DCM which replicates several known PCD disease aspects and revealed disease-specific novel pathways and composition of cellular subclusters.

Primäre Carnitindefizienz (PCD) ist eine autosomal rezessiv-vererbte monogenetische Erkrankung, die durch Mutationen im Gen SLC22A5 verursacht wird. PCD-Patienten leiden unter Muskelschwäche und dilatativer Kardiomyopathie, welche durch eine verminderte zelluläre Carnitin-Aufnahme durch den SLC22A5 codierten Transporter OCTN2 hervorgerufen wird. PCD-Patienten benötigen eine lebenslange orale L-Carnitin-Supplementation. Zwei Krankheitsmechanismen werden als relevant angesehen: Ein gestörter mitochondrialer Transport von Acylcarnitin führt zu verminderter mitochondrialer ATP-Produktion, und der reduzierte Fettsäurestoffwechsel führt zu zytoplasmatischer Acyl-CoA-Akkumulation,Ceramidbildung und Lipotoxizität. Die detaillierten Mechanismen der PCD sind jedoch unzureichend verstanden, weshalb prädiktive PCD-In-vitro-Modelle benötigt werden. In diesem Zusammenhang wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei humane induzierte pluripotente Stammzell (hiPSC)-linien mittels CRISPR/Cas9-Genom-Editierung generiert, welche einen vollständigen OCTN2-Knockout (OCTN2 (-/-)) als auch eine klinisch relevante homozygote Punktmutation (OCTN2 (N32S)) tragen. Die isogene Kontroll-Zelllinie sowie die genomeditierten Zelllinien wurde zu Kardiomyozyten differenziert und dreidimensionale Herzgewebe (Engineered heart tissue, EHT) hergestellt. Die Auswirkung des OCTN2-Genotyps auf Kontraktionsparameter, das Proteom, das Einzel-Zell-Transkriptom und die ultrastrukturelle Morphologie wurden analysiert. In Analogie zur oralen L-Carnitin-Supplementation bei PCD-Patienten wurde der Effekt einer L-Carnitin-Medium-Supplementation (2 mM) auf kontraktile Parameter und den Acylcarnitin- sowie Ceramid-Gehalt des Gewebes untersucht. OCTN2-defekte Genotypen zeigten eine geringere Effizienz der Kardiomyozyten Differenzierung (Kardiomyozyten-Output pro hiPSC-Input), aber keinen Unterschied in der Reinheit der Kardiomyozyten, was durch einen hohen prozentualen Anteil an cTNT-positiven Zellen gezeigt wurde. OCTN2 (-/-) EHTs wiesen unter Ausgangsbedingungen eine geringere Kraft und Länge im relaxierten Zustand, sowie eine längere Kontraktionszeit auf. Ein ähnlicher Trend wurde auch für OCTN2 (N32S) beobachtet, der jedoch aufgrund der großen Datenstreuung und der geringeren Effektgröße keine Signifikanz erreichte. Im Gegensatz zur isogenen Kontrolle, wies die Kraftentwicklung beider OCTN2-defekten EHTs eine positive Korrelation mit der Kardiomyozytenreinheit (% der TNT-positiven Zellen) auf, was auf einen starken Einfluss der Nicht-Kardiomyozyten auf den Krankheitsphänotyp in diesem Modell hindeutet. OCTN2-defekte EHTs zeigten molekulare Veränderungen, die den Merkmalen von beschriebene PCD-Tiermodellen ähneln, wie z. B. die Akkumulation von Lipidtröpfchen im Myokard, eine höhere Glukoseaufnahme und eine kompensatorische Hochregulierung von Proteinen, die am Carnitin-Shuttle-System beteiligt sind. Weitere Defekte im mitochondrialen Stoffwechsel wurden durch eine geringere mitochondriale DNA-Abundanz, eine defekte mitochondriale Morphologie und indirekt durch eine verminderte Kraftentwicklung in Fettsäuremedium im Zeitverlauf nachgewiesen. Eine TMT-basierte Proteomanalyse ergab eine geringere Abundanz von Proteinen, die an der Glykolyse und dem Pyruvat-Stoffwechsel beteiligt sind, sowie eine Dysregulation von Proteinen, die mit dem Citratzyklus und der oxidativen Phosphorylierung assoziiert sind. Die Beeinträchtigung des Pyruvat-Stoffwechsels wurde durch eine Hochregulierung der Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase 4 (PDK4) auf mRNA-Ebene unterstützt. Weiterhin deutete eine höhere Abundanz von extrazellulären Matrix-Proteinen auf die Relevanz von Fibroblasten in diesem Modell hin, was durch ein prominentes Cluster von aktivierten Fibroblasten in OCTN2-defekten EHTs in der Einzelnukleus-RNASequenzierung unterstützt wurde. Die O-verknüpfte Glykosylierung, eine posttranslationale Modifizierung, die kürzlich im Zusammenhang mit kardialer Hypertrophie beschrieben wurde, wurde in der Proteomanalyse als ein Mechanismus identifiziert, der möglicherweise zur metabolischen Remodelierung von PCD beiträgt. Darüber hinaus wurde der eisen- und lipidabhängige Zelltodmechanismus Ferroptose als neuer Signalweg in OCTN2-defekten Genotypen identifiziert. L-Carnitin-Medium- Supplementation normalisierte den Acylcarnitin-Gehalt im Gewebe und PDK4-Transkriptionswerte auf Werte der isogenen Kontrolle, und verringerte die Akkumulation von Lipidtröpfchen sowie den Glukoseverbrauch normalisiert zur kontraktilen Arbeit der EHTs. Diese Intervention hatte jedoch nur eine geringe Auswirkung auf die Kraftentwicklung und die Länge im relaxierten Zustand der EHTs und konnte die COL1A1-mRNA-expression in OCTN2 (N32S) EHTs nicht signifikant verringern, was darauf hindeutet, dass die Supplementation nicht alle Aspekte des Krankheitsphänotyps verhindern konnte. Die Einzelnukleus-RNA-Sequenzierung ergab zusätzlich eine unterschiedliche Clusterbildung von Kardiomyozyten-Subpopulationen zwischen isogenen Kontroll- und OCTN2-defekten EHTs. Weiterhin zeigten sich unterschiedliche Expression von Stoffwechsel-relevanten Modulatoren wie FOXO1 und ESR1. Nicht-Kardiomyozyten-Populationen wie Fibroblasten, Endothelzellen und Endokard-ähnliche Zellen waren in OCTN2-defekten EHTs angereichert. Darüber hinaus war die stärkere Repräsentation eines Leukozyten-Clusters in OCTN2-defekten EHTs mit einer höheren myeloischen Differenzierungsneigung der mesodermalen Vorläuferzellen vereinbar. Insgesamt wurde in dieser Studie ein humanes In-vitro-Modell für PCD DCM entwickelt, das mehrere bekannte PCD Krankheitsaspekte nachbildet und neue krankheits-spezifische Signalwege sowie die Zusammensetzung von zellulären Subpopulationen identifizieren konnte.