Avaliação da função biológica do sistema de dois componentes SptRS de Streptococcus mutans

Orientador: Renata de Oliveira Mattos-Graner

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba

Made available in DSpace on 2018-08-27T04:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vizoto_NataliaLeal_D.pdf: 2014309 bytes, checksum: c9893c670e96978a4923d0db115c76f9 (MD5) Previous issue date: 2015

Streptococcus mutans é uma espécie bacteriana comum da microbiota bucal de seres humanos envolvida na patogênese da cárie dentária e em endocardites infecciosas promovidas por bacteremias de origem bucal. Para ser transmitido e ocupar seus nichos ecológicos, S. mutans precisa persistir na saliva e se adaptar fisiologicamente a cada fase da colonização, um processo que provavelmente envolve diversas alterações do seu transcriptoma. Para isto, S. mutans utiliza sistemas reguladores de transcrição de dois componentes (SDC). O SDC SptRS foi identificado através de análises in silico do genoma da cepa S. mutans UA159, como ortólogo do sistema SptSR (Spt de Saliva persistence) de Streptococcus pyogenes. O objetivo deste trabalho foi investigar a participação do sistema SptRS de S. mutans em fenótipos importantes para a colonização bucal. Para isto, mutantes knockout dos genes sptR e sptS, SMU.927 e SMU.928 respectivamente, foram construídos a partir da cepa UA159 (UAsptR- e UAsptS-) e comparados com a cepa parental em análises de morfologia, crescimento planctônico sob diferentes condições nutricionais, persistência em saliva humana, formação de biofilme e autólise a 44oC. Além disto, genes do regulon de SptRS foram pesquisados através de ensaios da Imunoprecipitacão de Cromatina seguido de sequenciamento (ChIP-seq), RT-PCR quantitativo (RT-PCRq) e de Ensaios de Retardamento da Mobilidade Eletroforética (EMSA) com proteína recombinante SptRr de S. mutans. Os mutantes sptR e sptS mostraram crescimento planctônico lento em meios de cultura RPMI e em MQD comparados à cepa parental, além de atividade autolítica reduzida em 22,4 e 53,13%, respectivamente. Não foram observadas, entretanto, alterações significativas na morfogênese, formação de biofilmes in vitro, nem na persistência em saliva humana. Os dados de ChIP-seq e RT-qPCR indicaram que SptRS regula genes envolvidos na resposta de estringência (SMU.926), repressão catabólica (ccpA), metabolismo de múltiplos açúcares (SMU.78, SMU.137, SMU.542, SMU.1734), sistemas fosfoenolpiruvato-fosfotransferase (PTS) (SMU.2047, SMU.114, SMU.115) sistemas de transporte do tipo ABC (SMU.182, SMU.880, SMU.905, SMU.1035, SMU.1095, SMU.1178c, SMU.1939) e biogênese de parede celular (SMU.1091, SMU.2147, SMU.609, SMU.1434c, SMU.22). SptR funcionou como um regulador negativo em 86% (37/43) dos genes testados. Análises de RT-qPCR e EMSA indicaram ainda que SptR regula diretamente o regulador de transcrição CovR (SMU.1924), envolvido na repressão de genes de virulência e formação de biofilmes. Este estudo fornece evidências de que SptRS regula diversas funções de S. mutans importantes para a sobrevivência em condições nutricionalmente escassos, aparentemente coordenando o metabolismo com o crescimento bacteriano e com a expressão de genes de virulência

Streptococcus mutans is a common bacterial species of the bucal microbiota of humans involved in the pathogenesis of dental caries and infectious endocarditis promoted by bacteremia of bucal origin. To be transmitted and occupy their ecological niches, S. mutans need to persist in saliva and adapt physiologically to each phase of colonization, a process that probably involves several changes in its transcriptome. To this end, S. mutans uses transcriptional regulatory systems called Two Component System (TCS). The TCS SptRS was identified in an in silico analysis of the genome of S. mutans strain UA159, as an orthologue of the SptRS system (Spt of Saliva persistence) of Streptococcus pyogenes. The aim of this study was to investigate the role of the TCS SptRS in functional traits important for S. mutans to colonize its bucal niches. Thus, knockout mutants of sptR and sptS (SMU.927 and SMU.928, respectively) were obtained in strain UA159 (UAsptR-, UAsptS-) and compared to parental strain regarding morphology, planktonic growth under different nutritional conditions and persistence in human saliva, biofilm formation and autolysis at 44oC. In addition, genes of SptRS regulon were analised by Chromatin Immunoprecipitation followed the sequencing (ChIP-seq), quantitative RT-PCR (RT- qPCR) and Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) with S. mutans SptR recombinant protein. Inactivation of sptR/S promotes slow planktonic growth in RPMI and CDM, culture media 22.4 to 53.13% reductions in autolysis respectively, but does not significantly affect morphogenesis. However, mutants do not show significant alterations in biofilm formation or in persistence in human saliva. ChIP-seq and RT-qPCR analyses showed that SptRS regulates genes for stringent response (SMU.926), metabolism of multiple sugars (SMU.78, SMU.137, SMU.542, SMU.1734), catabolite repression (SMU.1591, ccpA), phosphoenolpyruvate phosphotransferase systems (PTS), ABC transport systems (SMU.182, SMU.880, SMU.905, SMU.1035, SMU.1095, SMU.1178c, SMU.1939) and cell wall biogenesis (SMU.22, SMU.609, SMU.1091, SMU.1434c, SMU.2147) SptR worked as a negative regulator of 86% (37/43) of the tested genes. RT-qPCR and EMSA analyses further showed that SptR directly represses expression of the transcriptional regulator CovR (SMU.1924), which is a repressor of genes involved in biofilm formation and virulence. This study provides evidence that SptRS regulates several functions important for S. mutans survival under poor nutritional conditions, apparently coordinating metabolism with bacterial growth and expression of virulence genes

Doutorado

Microbiologia e Imunologia

Doutora em Biologia Buco-Dental