A microbiota do bago de uva - abordagens moleculares para compreender a contribuição da cultivar na sua diversidade

Dissertação de mestrado Genética Molecular

A superfície do bago de uva é colonizada por uma comunidade microbiana complexa, incluindo bactérias, leveduras e fungos filamentosos que condicionam a qualidade do fruto e do vinho e cuja diversidade e dinâmica são fortemente influenciadas pela localização geográfica da vinha, pelos tratamentos fitossanitários e por vários fatores edafoclimáticos. No entanto, a origem da microbiota e a forma como a composição química do fruto afeta a sua diversidade são temas de investigação relevantes com implicações importantes na biotecnologia dos vinhos. Deste modo, o principal objetivo do presente trabalho consistiu em compreender a interação entre a composição química do bago de uva e a sua comunidade microbiana, nas cultivares Sousão, Touriga Nacional e Viosinho da região DOC Douro, visando avaliar a contribuição da cultivar para a microbiota superficial do fruto. Duas metodologias complementares de identificação e caracterização da microbiota dos bagos de uva foram utilizadas, a primeira dependente de cultura baseada na sequenciação de Sanger e a segunda independente de cultura baseada na análise de NGS metabarcoding. Dezasseis espécies de levedura foram identificadas através do método dependente de cultura em meio diferencial WL o que permitiu construir um catálogo. Aureobasidium pullulans, Curvibasidium pallidicorallinum, Filobasidium wieringae, Hanseniaspora uvarum, Holtermanniella festucosa e Sporobolomyces roseus foram encontradas nas 3 cultivares. Através do método de NGS metabarcoding foram identificadas 380 OTUs de fungos e 390 de bactérias, das quais 47% e 34%, respetivamente, foram detetadas em todas as cultivares, podendo refletir o núcleo microbiano da vinha. De acordo com os índices de Chao1 e Shannon, verificou-se ainda que a diversidade alfa foi superior em Viosinho, seguido de Sousão e Touriga Nacional, mostrando que Viosinho é a cultivar com maior biodiversidade de espécies, destacando-se Ascomycota, Proteobacteria e Actinobacteria como os filos mais abundantes. Da análise PCA entre a microbiota e os parâmetros bioquímicos do bago de uva, foi possível associar os níveis de acidez titulável e pH com a expressão dos filos raros Armatimonadota, Chytridiomycota, Mortierellomycota e Chloroflexi. Para os filos mais abundantes Proteobacteria, Ascomycota e Basidiomycota não se observou uma relação direta com os parâmetros bioquímicos, sugerindo que outros fatores específicos de cada cultivar poderão determinar as proporções dos diferentes taxa. O presente trabalho desenvolveu-se no âmbito do projeto FCT GrapeMicrobiota (PTDC/BAA-AGR/2691/2020) que prevê também estudos de metabolómica que permitirão obter uma descrição mais detalhada da contribuição da composição do bago para a estrutura das comunidades microbianas.

The surface of the grape berry is colonized by a complex microbial community, including bacteria, yeasts and filamentous fungi that affect the quality of the fruit and wine and whose diversity and dynamics are strongly influenced by the geographical location of the vineyard, by phytosanitary treatments and by various edaphoclimatic factors. However, the origin of the microbiota and the way in which the chemical composition of the fruit affects its diversity are relevant research topics with important implications for wine biotechnology. Thus, the main objective of the present work was to understand the interaction between the chemical composition of the grape berry and its microbial community, in the cultivars Sousão, Touriga Nacional and Viosinho of the DOC Douro region, in order to evaluate the contribution of the cultivar to the microbiota of the surface of the fruit. Two complementary methodologies for identifying and characterizing the microbiota of grape berries were used, the first culture-dependent based on Sanger sequencing and the second culture independent based on NGS metabarcoding analysis. Sixteen yeast species were identified through the culture dependent method in WL differential medium, which allowed the construction of a catalogue. Aureobasidium pullulans, Curvibasidium pallidicorallinum, Filobasidium wieringae, Hanseniaspora uvarum, Holtermanniella festucosa and Sporobolomyces roseus were found in the 3 cultivars. Through the NGS metabarcoding method, 380 OTUs of fungi and 390 of bacteria were identified, of which 47% and 34%, respectively, were detected in all cultivars, which may reflect the microbial nucleus of the vineyard. According to the indices of Chao1 and Shannon, it was also verified that the alpha diversity was higher in Viosinho, followed by Sousão and Touriga Nacional, showing that Viosinho is the cultivar with the greatest biodiversity of species, with Ascomycota, Proteobacteria and Actinobacteria comprising the most abundant phyla. From the PCA analysis between the microbiota and the biochemical parameters of the grape berry, it was possible to associate the levels of titratable acidity and pH with the expression of the rare phyla Armatimonadota, Chytridiomycota, Mortierellomycota and Chloroflexi. For the most abundant phyla Proteobacteria, Ascomycota and Basidiomycota no direct relationship with the biochemical parameters was observed, suggesting that other specific factors of each cultivar may determine the proportions of the different taxa. The present work was carried out within the scope of the FCT GrapeMicrobiota project (PTDC/BAA-AGR/2691/2020) which also includes metabolomics studies that will allow a more detailed description of the contribution of the berry composition to the structure of microbial communities.

Este trabalho foi apoiado pelo “Contrato-Programa” UIDB/04050/2020 financiado por fundos nacionais através da Fundação para a Ciência e a Tecnologia, FCT I.P. O trabalho contou ainda com o apoio da FCT, CCDR-N (Comissão de Coordenação e Desenvolvimento Regional do Norte de Portugal) e Fundos Europeus (FEDER/POCI/COMPETE2020) através dos projetos GrapeMicrobiota (PTDC /BAA AGR/2691/2020). Este trabalho beneficiou das atividades em rede do laboratório colaborativo CoLAB VINES & WINES e do projeto Fleurs locales (SOE4/P5/F1011).