Familial Hypercholesterolaemia: molecular and functional study of LDLR mutations

Dissertação de Mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentado à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2016.

Defendida e aprovada em 12 Dezembro de 2016.

Trabalho de investigação realizado no Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças Não Transmissíveis do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, Grupo de Investigação Cardiovascular (Setembro 2015 – Setembro 2016).

Orientadora Mafalda Bourbon: Departamento de Promoção da Saúde e Prevenção de Doenças não Transmissíveis, do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge.

Cardiovascular disease (CVD) remains the most common cause of death globally. Dyslipidaemia is one of the most important risk factors that leads to CVD. It can be due to a monogenic condition or to polygenic/environmental causes as diabetes, obesity, tobacco use, excess of alcohol or reduced physical activity. The identification of the individuals at risk and the distinction of these two types of dyslipidaemia is important for a correct cardiovascular risk assessment, counselling, and treatment reducing, this way, cardiovascular mortality. Familial hypercholesterolaemia (FH) is an autosomal dominant disorder of cholesterol metabolism. Most commonly, FH results from inherited defects in the Low-Density Lipoprotein Receptor Gene (LDLR) leading to increased levels of circulating LDL cholesterol and lipid accumulation in arteries and tendons. Mutations in other genes as the apolipoprotein B gene (APOB) and proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 gene (PCSK9), are also responsible for FH. The distribution pattern of apolipoprotein E gene (APOE) polymorphisms affects the affinity to lipoprotein receptors and, consequently, the clearance of dietary fat from the blood, also causing dyslipidaemia. The homozygous form of FH is rare and more severe, but the heterozygous form is common, with a frequency of 1/500 in most of European countries, although underdiagnosed in several populations, including the portuguese. FH is characterized by increased levels of plasmatic cholesterol since birth, which results in cholesterol deposits in extravascular tissues that can be identified in young patients (below 45 years old): xanthelasma, corneal arcus deposits and tendon xanthomas. This accumulation can cause premature arteriosclerosis and coronary heart disease (CHD). The presence of tendon xanthomas allows the differentiation of FH from other causes of hypercholesterolaemia as polygenic hypercholesterolaemia. More than 1700 different alterations in LDLR gene have been described worldwide. However, the functional studies for the great majority of these variants, have not been performed. For patients carrying these variants, a definitive molecular diagnosis for FH is not possible, representing a serious problem for FH diagnosis. In 1999, the Portuguese FH study was established at the National Institute of Health to identify the genetic cause of hypercholesterolaemia in individuals with a clinical diagnosis of FH. Index patients are included in this study using an adaptation of the Simon Broome (SB) criteria. Nonetheless, FH remains underdiagnosed and undertreated in the portuguese population. The main aim of this project was to perform the molecular identification of genetic variants in LDLR, APOB and APOE genes, causing dyslipidaemia in patients referred to the Portuguese FH Study in 2015/2016 with a clinical diagnosis of FH, in order to improve the identification of individuals at risk. Functional studies in RNA for putative splicing variants were also performed. The molecular diagnosis was performed for 60 index cases. Genomic DNA was isolated from peripheral blood lymphocytes using the salting out method. The 18 exons and promotor region of LDLR, part of exons 26 and 29 of APOB and exon 4 of APOE were amplified by PCR and sequenced by direct Sanger sequencing. A total of 18 variants were identified in 24 of these patients. The cascade screening in relatives of these 24 index patients allowed the identification and genetic characterization of additional 19 FH patients in Portugal. All alterations found have been previously reported, although only 11 had been functionally assessed. The search for large rearrangements was performed by Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). In silico analysis was performed for all the variants found. III In order to access the effect of splicing mutations, RNA was isolated from patients’ blood with RNeasy® Mini Kit (Qiagen), after isolation of peripheral blood mononuclear cells, and then transcribed to cDNA. Regions of interest were amplified with specific primers designed to evaluate the effect on cDNA of two of the tree putative splicing variants found in LDLR gene. Specific detection of each transcript was accessed by an agarose gel and the fragments were sequenced by Sanger sequencing. Both alterations lead to skipping of an entire exon and create premature stop codons: c.1060+1G>A causes an inactivation of the donor site in intron 7 resulting in skipping of exon 7; the alteration in the last nucleotide of exon 16 (c.2389G>A) creates a new acceptor site causing the skipping of exon 16. The early genetic identification of a mutation, confirming the clinical diagnosis of FH, is very important, especially for young patients, since they can receive appropriate dietary and lifestyle advice and adequate therapeutic measures providing them longer and better lives.

As doenças cardiovasculares (DCV) afetam o funcionamento normal do coração e dos vasos sanguíneos. Existem vários tipos de doenças cardiovasculares, sendo as principais a doença das artérias coronárias e a doença das artérias do cérebro. A doença coronária é, maioritariamente, provocada por aterosclerose, uma doença progressiva e inflamatória que resulta na formação de placas ateroscleróticas. Agentes infeciosos ou concentrações elevadas de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) no sangue podem levar ao aparecimento destas placas na parede interna das artérias impedindo a circulação sanguínea. As doenças cardiovasculares são uma das causas de morte mais comum no planeta. Fatores de risco como o uso de tabaco, obesidade, prática de exercício físico reduzida, consumo excessivo de álcool, diabetes, hipertensão, stress e dislipidémia aumentam a probabilidade de ocorrência prematura deste tipo de doenças. A dislipidémia é um dos mais importantes fatores de risco da aterosclerose, uma vez que se caracteriza por anomalias quantitativas ou qualitativas dos lípidos no sangue. A identificação de indivíduos em risco e o conhecimento da causa de hipercolesterolemia é de extrema importância para que estes indivíduos possam ser corretamente tratados evitando-se, assim, a morte devida a esta causa. A Hipercolesterolemia Familiar (FH) é uma doença autossómica dominante do metabolismo do colesterol. A FH é hereditária e resulta, maioritariamente, de mutações no gene do recetor das lipoproteínas de baixa densidade (LDLR) cuja função é a remoção do colesterol LDL do plasma, transportando-o para o fígado, onde é processado. Ficando esta função afetada, os níveis de colesterol LDL circulante, aumentam. Mutações noutros genes como o gene da apolipoproteína B-100 (APOB) e da pro-proteína convertase subtilisina/quexina tipo 9 (PCSK9) são também causa, embora menos frequente, desta doença. Alterações no gene da apolipoproteína E (APOE) afetam a afinidade com os recetores de lipoproteínas e, consequentemente, a remoção do colesterol do sangue, podendo também causar dislipidémia. A forma homozigótica da FH é rara e mais severa, mas a heterozigótica é comum embora sub-diagnosticada em muitas populações, nomeadamente na portuguesa. Estima-se que, na maioria dos países europeus, a prevalência destas duas formas seja 1/1000000 e 1/500 indivíduos, respetivamente. O colesterol total, na forma heterozigótica, varia entre 290 e 500 mg/dL (com LDL>190 mg/dl) e na forma homozigótica, habitualmente, encontra-se entre os 600 mg/dL e os 1000 mg/dL. O nível elevado de colesterol no plasma resulta, frequentemente, na formação de depósitos de colesterol nos tecidos extravasculares que, por vezes, podem ser facilmente identificados em indivíduos ainda jovens (abaixo dos 45 anos): xantelasmas, arco corneano e, mais difíceis de reconhecer mas mais específicos, os xantomas nos tendões. A presença de valores altos de colesterol LDL desde o nascimento, característico desta doença, leva a um incremento do risco de doença coronária prematura. Este fenótipo permite diferenciar a FH de outras causas de hipercolesterolemia, nomeadamente da hipercolesterolemia comum ou poligénica, embora nem sempre seja fácil essa diferenciação. Foram descritas, em todo o mundo, mais de 1700 mutações diferentes no gene LDLR. Contudo, grande parte destas não possuem estudos funcionais, o que impede o diagnóstico definitivo destes doentes. Em 1999 iniciou-se no Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge o Estudo Português de Hipercolesterolemia Familiar. Este estudo tem como objetivos a pesquisa de alterações genéticas que possam confirmar o diagnóstico clínico de FH em indivíduos da população portuguesa e a determinação da prevalência e distribuição da FH em Portugal. Os casos índex são incluídos no estudo caso cumpram os critérios adaptados de Simon Broome. Estes critérios categorizam a FH como “definitiva” ou “possível”, sendo que a primeira se define, em adultos, por valores de colesterol total acima de 290 mg/dL ou de colesterol LDL acima de 190 mg/dL, e em crianças, até aos 16 anos de idade, por uma concentração de colesterol total cima de 260 mg/dL ou de colesterol LDL acima de 155 mg/dL, com presença de xantomas no doente ou num familiar de primeiro ou segundo grau ou ainda quando existe evidência genética de uma mutação num dos 3 genes que cause FH. O diagnóstico “possível” requer a presença de níveis de colesterol acima destes valores, valores totais de colesterol acima dos 290 mg/dL num familiar de primeiro ou segundo grau e história familiar ou enfarte do miocárdio antes dos 50 anos num familiar de segundo grau ou antes dos 60 anos num familiar de primeiro grau. Sempre que possível, após a identificação da possível alteração causadora de doença é feito o estudo funcional para as variantes de patogenicidade desconhecida, para que o diagnóstico seja o mais completo e definitivo possível, contribuindo para uma abordagem terapêutica mais personalizada. O principal objetivo deste estudo foi a identificação molecular de variantes genéticas nos genes LDLR, APOB e APOE que provoquem dislipidémia. Os doentes referenciados para o Estudo Português de Hipercolesterolemia Familiar em 2015/2016 foram o alvo deste projeto. A realização de estudos funcionais ao nível do RNA para variantes que afetam o splicing foi também objetivo deste estudo. Neste projeto, foram estudados 60 casos índex incluídos no Estudo Português de Hipercolesterolemia Familiar. O estudo molecular foi dividido em várias fases: 1. O DNA genómico é isolado a partir dos linfócitos do sangue periférico; 2. Os 18 exões, regiões adjacentes e o promotor do gene LDLR, parte dos exões 26 e 29 do gene APOB e o exão 4 do gene APOE foram amplificados por PCR e sequenciados pelo método de sequenciação direta de Sanger. As sequências foram analisadas em computador e comparadas com as sequências de referência de forma a detetar variantes que possam ser a causa desta doença, confirmando o diagnóstico clínico; 3. Estudo de grandes rearranjos por Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). Foram realizadas predições in silico para todas as alterações encontradas para prever o seu impacto ao nível da proteína. Para as alterações em regiões codificantes foram utilizadas as ferramentas PolyPhen-2, SIFT, PROVEAN e Mutationtaster. As ferramentas HSF, NNSSP e FSPLICE foram usadas para prever o efeito no splicing causado pelas alterações em regiões intrónicas. Quando nenhuma mutação é encontrada nestes três genes e o doente apresenta um fenótipo agressivo, procede-se à pesquisa no gene PCSK9 e em todo o gene APOB, representando a quarta fase do estudo molecular. Quando são encontradas variantes de patogenicidade desconhecida, são realizados estudos funcionais in vitro (fase 5). Embora o estudo completo dos genes PCSK9 e APOB não tenha sido realizado durante este trabalho, foram feitos estudos funcionais ao nível do RNA. No total, foram identificadas 18 variantes diferentes em 24 destes doentes: 16 no gene LDLR, 1 no gene APOB e 1 no gene APOE. Apenas 11 destas apresentam estudo funcional. Sempre que existia amostra disponível, foi feito também o estudo genético dos familiares, o que permitiu a identificação e caracterização genética adicional de 28 indivíduos, num total de 43 doentes com uma alteração possivelmente patogénica. Entre estas mutações encontram-se 3 nonsense, 12 missense e 3 que possivelmente afetam o splicing. Uma destas mutações foi descrita, pela primeira vez, em Portugal neste projeto. A análise de grandes rearranjos não revelou alterações deste tipo no grupo em estudo. A confirmação dos efeitos causados ao nível do splicing foi feita para duas das três alterações de splicing encontradas no gene LDLR durante este projeto. Para tal, recorreu-se ao isolamento das células mononucleares do sangue periférico dos doentes e à extração do RNA utilizando o RNeasy® Mini Kit (Qiagen). Após retrotranscrição para cDNA e amplificação da zona a estudar utilizando primers específicos, as bandas em gel de agarose foram analisadas e os fragmentos foram sequenciados. As duas alterações em causa levam ao skipping de exões e ao aparecimento de codões stop prematuros: no caso da alteração c.1060+1G>A, a inativação do donor site no intrão 7 resulta no skipping do exão 7; a alteração no último nucleótido do exão 16 (c.2389G>A) leva ao aparecimento de um novo acceptor site e, consequentemente, ao skipping do exão 16. A FH é caracterizada por níveis elevados de colesterol plasmático desde a nascença. Por isso, é de extrema importância que o diagnóstico seja feito o mais cedo possível, principalmente em idade pediátrica para que estas crianças recebam acompanhamento médico personalizado durante toda a vida, prevenindo o aparecimento de DCV prematura, permitindo, assim, uma melhor e maior esperança de vida. No entanto, é necessária uma maior divulgação da doença, principalmente junto do corpo clínico dos hospitais e centros de saúde assim como junto do público em geral. Só após a identificação clínica se pode realizar o estudo genético para comprovar a doença e o doente pode então receber acompanhamento e tratamento personalizado.