Characterization of the Rho GTPase Activating Protein, ARHGAP8, in the Central Nervous System

Tese no âmbito do doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina, ramo de Neurociências e Doença, orientada pela Professora Doutora Ana Luísa Monteiro de Carvalho e apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar da Universidade de Coimbra.

Neurodevelopmental- and neuropsychiatric disorders are complex traits that present an increasing clinical and social burden on a worldwide level. Much of the abnormal function has been traced back to malformations and -functions of synaptic connections established between circuitry neurons. It is therefore not surprising that many of the identified risk genes code for proteins that are critical to the neuro-morphological and synaptic set-up. As a response to input changes in their environment, networks persistently need to adjust the number and strength of the synapses formed between their component cells. In fact, the structural and functional adjustments of synapses, also known as synaptic plasticity mechanisms, are generally considered as the cellular basis to learning and memory processes. Anomalous synapse numbers and efficacies are features of many cognitive disorders. Synaptic adjustments can be particularly well observed on excitatory glutamatergic neurons whose postsynaptic entities can be found at the tips of small dendritic protrusions, called dendritic spines. Increased or lowered activity in synaptic communication is commonly associated with the plasticity mechanisms of long-term potentiation (LTP) or depression (LTD), respectively. In case of the former, the cellular response requires the surface insertion of glutamatergic AMPA receptors whereas the latter necessitates their removal. These modifications are commonly accompanied by spinal size growth or shrinkage accordingly. For neurons to undergo any structural modifications - achieving their correct position and morphology during development or simply to allow for these synaptic adjustments - they rely heavily on their underlying actin cytoskeleton. The cytoskeleton is tightly orchestrated by the family of Rho GTPases which in turn are under strict regulation by their positive (Rho Guanine Nucleotide Exchange Factors – GEFs) and negative (Rho GTPase Activating Proteins – GAPs) regulators. In fact, abnormalities in the functioning of many of these regulatory proteins have been revealed to be involved in the unfolding of numerous cases of neurodevelopmental and -psychiatric disorders (NDDs and NPDs, respectively). The focus of this work evolves around the GAP ARHGAP8, a protein that has been identified as a novel synaptic component by two of our earlier studies and that has not previously been studied in a cerebral context. Keeping in mind that the spatio-temporal distribution of Rho regulatory proteins is crucial to the appropriate development and function of the brain, we first describe ARHGAP8’s developmentally regulated, widespread distribution within the brain, identifying certain hotspots of heightened expression with potential evidence for cell specificities. Our data further delineates ARHGAP8 levels at the excitatory synapse with indications for a correlation between ARHGAP8 presence and synapse size. There is an increasing amount of literature and database evidence showing a connection between abnormal ARHGAP8 function and NPDs and NDDs. Artificially enhancing ARHGAP8’s expression levels in murine culture models to mimic the increased copy number variance found in a subset of reported patients, we found evidence for significant changes to the neuronal and synaptic set-up even under basal conditions. Dendritic arborization was substantially destabilized and the synaptic structure and function were similarly impacted, with decreased spinal volume and lowered PSD95 and AMPA receptor content. Lastly, we looked into the connection between ARHGAP8 and the NMDA receptor subunit GluN2B. After our research previously revealed that ARHGAP8 vanishes from cortical postsynaptic density structures of neurons that lack this particular subunit, we now report that they indeed are part of the same macromolecular complex. Additionally, we put data forward showing abnormally intensified RhoA activity at the synapses of these cells. Considering the importance of faultless synaptic signalling for unerring brain function and the crucial role GluN2B plays during its early development, our identification of ARHGAP8 as a novel GluN2B-interacting partner and the impact it has on excitatory synaptic assembly, suggests a paramount role of the protein in neuronal function and make it a compelling target for cognitive disorder-related research.

Distúrbios do neurodesenvolvimento e distúrbios neuropsiquiátricos são doenças complexas cuja carga clínica e social tem vindo a aumentar a um nível global. Estes surgem devido à formação ou manutenção aberrante dos circuitos cerebrais, afetando aspetos da memória, perceção, tomada de decisão, entre outros. De facto, uma parte considerável da função anómala foi relacionada com malformação ou disfunção das conexões sinápticas que se estabelecem entre neurónios. Sendo assim, é pouco surpreendente que muitos dos genes considerados de risco codifiquem proteínas cruciais para o desenvolvimento morfológico e sináptico. Em resposta à receção e assimilação dos constantes estímulos externos, as redes neuronais necessitam de ajustar o número e a força das sinapses estabelecidas entre as células que as compõem. Estas alterações estruturais e funcionais das sinapses, também designadas por mecanismos de plasticidade sináptica, são geralmente consideradas como a forma celular de processos de aprendizagem e memória. O número aberrante de sinapses e disfunção da transmissão sináptica são características comuns a vários distúrbios cognitivos. Os processos de plasticidade sináptica podem ser facilmente observados em neurónios glutamatérgicos, cujas densidades pós-sinápticas estão localizadas na extremidade de pequenas protrusões dendríticas, denominadas espículas dendríticas. Atividade sináptica elevada ou diminuída é frequentemente associada com mecanismos de plasticidade de potenciação (LTP – long-term potentiation) ou de depressão (LTD – long-term depression) de longo termo, respetivamente. No caso da LTP, a resposta celular requer a inserção superficial de recetores glutamatérgicos do tipo AMPA enquanto que para induzir LTD é necessária a remoção destes recetores. Estas modificações são frequentemente acompanhadas por uma alteração no volume da espícula dendrítica, que aumenta ou diminuí de acordo com o paradigma de atividade. Para os neurónios passarem por qualquer alteração estrutural – alcançando a sua posição e morfologia correta durante o desenvolvimento ou ajustando a transmissão sináptica – dependem do seu citoesqueleto de actina. O citoesqueleto está sujeito a um forte controlo pela família das GTPases Rho que por sua vez são fortemente reguladas pelos seus próprios reguladores positivos (Rho Guanine Nucleotide Exchange Factors – GEFs) e negativos (Rho GTPase Activating Proteins – GAPs). De facto, aberrações no funcionamento de muitas destas proteínas têm sido associadas a numerosos casos de distúrbios do neurodesenvolvimento e doenças neuropsiquiátricas (DNDs e DNPs, respetivamente). Este trabalho está focado na proteína GAP, ARHGAP8, que foi identificada como uma nova componente sináptica por dois dos nossos estudos anteriores e que antes do presente estudo não tinha ainda sido estudada no contexto cerebral. Tendo em conta que a distribuição espácio-temporal das proteínas reguladoras da Rho é crucial para um desenvolvimento apropriado e para a função cerebral, começámos por descrever a regulação da expressão da ARHGAP8 durante o desenvolvimento e a sua distribuição no cérebro, e identificámos enriquecimento em regiões do cérebro e populações celulares específicos. Avaliámos também os níveis de ARHGAP8 nas sinapses excitatórias, identificando uma correlação entre a presença de ARHGAP8 e a área da sinapse. A literatura e as bases de dados científicas mostram que existe uma ligação entre a função anómala de ARHGAP8 e DNDs e DNPs. De facto, os nossos resultados mostram que o aumento artificial da expressão desta proteína em neurónios de rato em cultura, para mimetizar o aumento do número de cópias do gene encontrado num grupo de pacientes, promove alterações significativas na configuração dos neurónios e sinapses mesmo em condições basais - a arborização dendrítica encontra-se substancialmente destabilizada e a estrutura e função sinápticas mostram um impacto semelhante, com diminuição do volume das espículas e uma diminuição na expressão de PSD e recetores AMPA. Por último, olhamos para a ligação entre a ARHGAP8 e a subunidade GluN2B dos recetores glutamatérgicos do tipo NMDA. Após estudos anteriores do nosso grupo terem revelado que a ARHGAP8 se encontra ausente da estrutura das densidades pós-sinápticas de neurónios corticais que não expressam esta subunidade, reportamos agora que ARHGAP8 e GluN2B fazem parte de um mesmo complexo macromolecular. Adicionalmente, mostramos que células sem GluN2B apresentam uma atividade aumentada de RhoA nas sinapses. Considerando a importância que defeitos na sinalização sináptica têm na função neuronal e o papel crítico que o GluN2B desempenha durante as fases iniciais do desenvolvimento, a nossa identificação de ARHGAP8 como um novo interator de GluN2B e o impacto que esta tem na morfologia e função de sinapses excitatórias sugerem um papel proeminente para a ARHGAP8 na função neuronal, e tornam esta proteína um alvo interessante para estudar no âmbito de distúrbios cognitivos.