Characterization of MJD patient´s iPSC-derived NESC silenced for mutant ataxin-3

Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de Medicina

A doença de Machado-Joseph (DMJ) é uma doença neurodegenerativa rara, caracterizada por morte neuronal, levando à falta de coordenação dos movimentos musculares voluntários, falta de equilíbrio, oftalmoplegia, neuropatia periférica, e alterações psiquiátricas. Esta condição neurodegenerativa é caracterizada por uma expansão anormal do trinucleótido CAG no gene ATXN3, resultando num tracto de poliglutamina expandido na proteína ataxina-3, conferindouma função tóxica a esta proteína. Atualmente não existe tratamento eficaz contra a progressão desta patologia.Estudos de terapia celular têm reportado resultados muito promissores na neuroprotecção e substituição celular em doenças neurodegenerativas. As células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC) são obtidas através da reprogramação de células somáticas em células estaminais pluripotentes. Para o transplante autólogo é possível reprogramar células do doente a tratar, tornando exequível a implementação de terapias celulares personalizadas. As iPSC são subsequentemente induzidas em células da neuroectoderme, nomeadamente células estaminais neuroepiteliais (NESC). Estudos anteriores demonstraram o potencial destas células para transplante autólogo, no entanto, no caso particular da DMJ é necessário silenciar a ataxina-3 mutante, responsável pela doença, antes que as células possam ser utilizadas em aplicações terapêuticas.Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo estabelecer linhas celulares NESC derivadas de iPSC de doentes com a DMJ, com o mRNA da ATXN3 mutante silenciado e avaliar a sua potencial utilização em estratégias de substituição celular e de neuroprotecção em doenças neurodegenerativas como a DMJ. Para alcançar este objetivo, foram utilizados lentivírus codificados com um shRNA desenhado para silenciar especificamente o mRNA da ATXN3 mutante. Os nossos dados demonstraram que após o silenciamento existe uma redução significativa de 60% nos níveis de proteína de ataxina-3 mutante nas NESC derivadas de iPSC de doentes, sem afetar os níveis da proteína ataxina-3 wild-type. Além disto, as linhas celulares estabelecidas demonstraram capacidade de diferenciação em neurónios funcionais e células da glia. As células silenciadas para o gene ATXN3 mutante foram transplantadas no cerebelo e no estriado de murganhos adultos, nomeadamente num modelo lentiviral de DMJ. Dois meses após o transplante as NESC sobreviveram e foram capazes de se diferenciar em neurónios e células da glia. Além disso, foram detetados neurónios humanos derivados dos enxertos capazes de estabelecer sinapses excitatórias e inibitórias no cérebro hospedeiro. Finalmente, não foram observados sinais de rejeição imunológica nem proliferação excessiva dos enxertos, atestando a segurança do transplante. Os nossos resultados demonstraram que apesar do transplante das DMJ NESC com a ATXN3 mutante silenciada não promoverem um aumento dos fatores neurotróficos ou dos níveis de marcadores de proliferação dos progenitores neurais, desencadearam uma redução significativa no tamanho das inclusões de ataxina-3 mutante, um dos mais importantes marcadores clínicos da DMJ. No entanto, são necessárias mais experiências, nomeadamente a avaliação do efeito terapêutico in vivo de mais linhas celulares NESC derivadas de iPSC DMJ silenciadas para o gene ATXN3 mutante, e da linha celular precursora NESC derivada de iPSC DMJ, de forma a compreender melhor o impacto do silenciamento do gene ATXN3 mutante no potencial terapêutico das linhas celulares estabelecidas.

Machado-Joseph disease (MJD) is a rare neurodegenerative disease characterized by neuronal death, leading to lack of coordination of voluntary muscle movements, lack of balance, ophthalmoplegia, peripheral neuropathy, and psychiatric changes. This neurodegenerative condition is characterized by an abnormal expansion of the CAG trinucleotide in the ATXN3 gene, translated into an expanded polyglutamine tract in the ataxin-3 protein, which confers toxic gain of function to ataxin-3. Currently, there is no effective treatment against the progression of this pathology.Cell therapy studies have been reporting very promising neuroprotection and cell replacement results in neurodegenerative diseases. The induced pluripotent stem cells (iPSC) are obtained by reprogramming somatic cells into pluripotent stem cells. For autologous transplantation its doable to reprogram cells of the patient to be treated, making possible to implement personalized cell therapies. The iPSC are then induced into cells of the neuroectoderm, namely neuroepithelial stem cells (NESC). Some studies have already demonstrated the potential of these cells for autologous transplantation, however in the particular case of MJD it is necessary to silence the mutant ataxin-3 gene responsible for the disease before cells can be used in therapeutic applications.Therefore, the present work aimed at establishing mutant ATXN3 mRNA depleted MJD iPSC-derived NESC cell lines and assessing their potential to be used as a cell-replacement and neuroprotective strategy in neurodegenerative diseases as MJD. To accomplish this objective, lentivirus encoding for an shRNA designed to specifically silence the mutant ATXN3 mRNA were used. Our data demonstrate a significant reduction of 60% in mutant ataxin-3 protein levels in the MJD iPSC-derived NESC upon silencing with shRNA Mut ATXN3, without affecting the wild-type ataxin-3 protein levels. Furthermore, the establish cell lines were able to differentiate into functional neurons and glial cells. Then, the silenced mutant ATXN3 MJD iPSC-derived NESC were transplanted into the cerebellum and the striatum of adult mice, namely in a lentiviral-induced MJD mouse model. Two months upon transplantation the NESC survived and were able to differentiate into glial cells and neurons. Moreover, graft-derived human neurons establishing excitatory and inhibitory synapses in the host brain were detected. Finally, no major signs of immune rejection or graft overproliferation were observed, attesting for the safety of the cell transplantation. Our data showed that although the transplanted silenced mutant ATXN3 MJD NESC did not promote the enhancement of the neurotrophic factors or neural progenitors’ proliferation markers levels, a significant reduction in the size of the mutant ataxin-3 protein inclusions was triggered, which is one of the most important clinical hallmarks of MJD. Nevertheless, further experiments are required, namely the evaluation of the in vivo therapeutic effect of more mutant ATXN3 silenced MJD iPSC-derived NESC cell lines and also the precursor MJD iPSC-derived NESC cell line, to better understand the impact of the mutant ATXN3 silencing on the therapeutic potential of the established cell lines.

Outro - This work was funded by the European Regional Development Fund (ERDF) through the Centro 2020 Regional Operational Programme under BrainHealth2020 projects (CENTRO-01-0145-FEDER-000008), through the COMPETE 2020 - Operational Programme for Competitiveness and Internationalization and Portuguese national funds via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, under projects - UIDB/04539/2020 and UIDP/04539/2020, POCI-01-0145-FEDER-030737 (NeuroStemForMJD, PTDC/BTM ORG/30737/2017), CEECIND/04242/2017, PhD Scholarships 2020.04751.BD and 2020.07385.BD. It was also funded by the National Ataxia Foundation, the French Muscular Dystrophy Association (AFM-Téléthon) Trampoline Grant #20126, EU Joint Programme – Neurodegenerative Disease Research (JPND) Project (JPCOFUND/0005/2015-ModelPolyQ), and the Richard Chin and Lily Lock Machado-Joseph Disease Research Fund.