Immunotolerance strategies to improve cell-bases therapy outcomes in MJD

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de Farmácia

Machado-Joseph disease (MJD), also known as Spinocerebellar Ataxia-type-3 (SCA3), is a neurodegenerative disease that belongs to the group of polyglutamine diseases, characterized by the CAG triplet repeat expansion in the Ataxin-3 protein. This mutant protein aggregates and causes neuronal dysfunction. MJD patients present motor coordination impairments as gait ataxia and neurological changes, such as neuronal loss and cerebellar atrophy. Presently there is no treatment available for MJD. Brain transplantation of stem cells aims to replace or repair damaged tissue/cells and it has been tested as a therapeutic approach for MJD. Cell therapy faces challenges regarding successful cell engraftment. Namely, when allogenic cells are transplanted, the immune system of the host’s brain promote graft rejection if immunosuppression is not used. Nevertheless, immunosuppressors also affect the ability of transplanted cells to differentiate, which is needed for a successful cell replacement therapy. Moreover, immunosuppression also exposes the host’s body to infections or cancer. In this way, the aim of this study is to understand if the intraperitoneal injection of human stem cells in newborn mice, with its immune system still developing, induces immunotolerance to the human cells. Since the mice immune system is still developing, if an earlier contact with the human cells is made, it is reported in other studies that there is immunotolerance induction to the human cells. Consequently, when human stem cells are transplanted into the brain, cells will be able to survive and differentiate without the use of immunosuppression.To test this hypothesis, wild-type and MJD transgenic mice submitted or not to immunotolerance were transplanted with human iPSC-derived NESCs expressing GFP to access cell survival, differentiation, and therapeutic effects in the cerebellum of mice. The results from this work showed that human induced pluripotent stem cells (iPSC)-derived neuroepithelial stem cells (NESC) were not able to survive 2 month after transplant and it was detected a reduced number of engrafted cells 1 month after transplantation. Cell differentiation markers revealed that cells that were able to survive did not present characteristics of differentiated cells, namely no neuronal (MAP2)- and astrocyte (GFAP) positive markers were detected in the grafts. The levels of neuroinflammation markers TNF-α, IL1β and iba-1 levels revealed a tendency of higher levels in wild-type and MJD transgenic mice submitted to immunotolerance compared to mice not submitted to immunotolerance. TLR3 levels also revealed a tendency of higher levels in wild-type and MJD transgenic mice submitted to immunotolerance.Overall, data from this work revealed that the immunotolerance induction strategy used in this study do not improve graft acceptance of human iPSC-derived NESC in the brain of mice. In fact, there was no significant cell survival and cell differentiation was not detected. In opposition to previous studies in which human iPSC-derived NESC survived and differentiated in the cerebellum of immunocompromised mice or in MJD mice submitted to immunosuppression.

A doença de Machado-Joseph (DMJ), também conhecida como Ataxia Espinocerebelosa Tipo 3 (SCA3), é uma doença neurodegenerativa que pertence ao grupo de doenças de poliglutaminas, caracterizada pela expansão da repetição de trinucleotídeos CAG na proteína Ataxina-3. Esta proteína mutante forma agregados e causa disfunção neuronal. Doentes com DMJ apresentam deficiências da coordenação motora, como ataxia da marcha, e alterações neurológicas, como perda neuronal e atrofia cerebelar.Atualmente, não há tratamento disponível para a DMJ. O transplante de células estaminais no cérebro visa substituir ou reparar tecidos/células danificados e tem sido testado como uma abordagem terapêutica para a DMJ. A terapia celular enfrenta desafios em relação ao sucesso do transplante de células. Quando células alogénicas são transplantadas, o sistema imunológico do cérebro do hospedeiro promove a rejeição do transplante se imunossupressores não forem usados. No entanto, os imunossupressores também afetam a capacidade das células transplantadas de se diferenciarem, o que é necessário para uma terapia de substituição celular bem-sucedida. Além disso, a imunossupressão expõe o corpo do hospedeiro a infeções ou cancro. Desta forma, o objetivo deste estudo é entender se uma injeção intraperitoneal de células estaminais humanas em murganhos recém-nascidos, com o seu sistema imunológico ainda em desenvolvimento, induz imunotolerância às células humanas. Como o sistema imunológico dos murganhos ainda está em desenvolvimento, se houver um contacto inicial com as células humanas, poderá existir indução de imunotolerância a estas células, como descrito noutros estudos. Consequentemente, quando as células estaminais humanas forem transplantadas no cérebro, as células serão capazes de sobreviver e diferenciarem-se sem o uso de imunossupressão.Para testar esta hipótese, murganhos wild-type e MJD submetidos ou não a imunotolerância foram transplantados com células estaminais neuroepiteliais (NESCs) derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) humanas, que expressavam GFP, para avaliar a sobrevivência celular, diferenciação e efeitos terapêuticos no cerebelo dos murganhos.Os resultados deste trabalho mostraram que as NESCs derivadas de iPSCs humanas não foram capazes de sobreviver 2 meses após o transplante, e foi detectado um número reduzido de células transplantadas 1 mês após o transplante. Marcadores de diferenciação celular revelaram que as células que conseguiram sobreviver não apresentam características de células diferenciadas, nomeadamente, não foram detectadas células positivas para marcadores de neurónios (MAP2) e astrócitos (GFAP). Os níveis dos marcadores de inflamação TNF-α, IL-1β e iba-1 revelaram uma tendência para níveis mais elevados em murganhos wild-type e MJD submetidos a imunotolerância em comparação com murganhos não submetidos a imunotolerância. Os níveis de TLR3 também revelaram uma tendência para níveis mais elevados em murganhos wild-type e MJD submetidos a imunotolerância.Em resumo, os resultados deste trabalho revelaram que a estratégia de indução de imunotolerância usada neste estudo não melhora a aceitação do enxerto de NESCs derivadas de iPSCs humanas no cérebro de murganhos. Na verdade, não houve sobrevivência significativa das células e a diferenciação celular não foi detectada, contrariamente ao que foi observado em estudos anteriores nos quais as NESCs derivadas de iPSCs humanas sobreviveram e diferenciaram-se no cerebelo de murganhos imunocomprometidos ou em murganhos MJD submetidos a imunossupressão.

Outro - This work was funded by the European Regional Development Fund (ERDF) through the Centro 2020 Regional Operational Programme under BrainHealth2020 projects (CENTRO-01-0145-FEDER-000008), through the COMPETE 2020 - Operational Programme for Competitiveness and Internationalization and Portuguese national funds via FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, under projects - UIDB/04539/2020 and UIDP/04539/2020, POCI-01-0145-FEDER-030737 (NeuroStemForMJD, PTDC/BTM-ORG/30737/2017), CEECIND/04242/2017. It was also funded by the National Ataxia Foundation, the French Muscular Dystrophy Association (AFM-Téléthon) Trampoline Grant #20126, EU Joint Programme – Neurodegenerative Disease Research (JPND) Project (JPCOFUND/0005/2015-ModelPolyQ), and the Richard Chin and Lily Lock Machado-Joseph Disease Research Fund.