ESTABLISHMENT OF PHENOTYPIC READOUTS FOR MEDIUM-THROUGHPUT SCREENING USING IPSCS NEURONAL CELLS FROM MJD PATIENTS

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de Farmácia

Machado Joseph disease (MJD), also known as spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3), is the most common form of dominantly inherited ataxia worldwide, presenting its’ highest prevalence (1:239) at the archipelago of Azores, Portugal.MJD is caused by an abnormal expansion of the trinucleotide CAG in ATXN3 gene, generating a mutant form of the ATAXIN-3 protein. This results in a ‘over-sized’ ATAXIN-3 protein, that tends to aggregate as intranuclear inclusions in neurons, leading to cellular toxicity and death. Despite MJD presents phenotypic heterogeneity, patients usually present loss of motor coordination, difficulty with speech and swallowing, and impaired eye movements sometimes accompanied by double vision or bulging eyes. MJD is very incapacitant and leads to premature death, being symptomatic therapy the only approach available. Thus, there is a huge demand for novel therapeutic strategies able to stop or delay disease progression.Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have shown a great potential for disease-modelling as they share the genetic background of patient they derive from. Due to their pluripotency, they can be differentiated into specific somatic cell types as, for instance, neuronal cells. These are particularly well suited for drug discovery of neurological diseases, overcoming the limitations regarding the access to human brain tissue. With the final goal to identify relevant phenotypic readouts to develop a medium-throughput screening (MTS) assay for drug testing using neuronal cultures derived from MJD patients’ iPSCs, we generated, characterized and biobank Neural Progenitor Cell (NPC) lines from healthy controls and MJD patients. We used a simple and short monolayer neural induction protocol to obtain NPC cultures. NPCs were then characterized by evaluating specific stem, neural progenitor, and neuronal cell markers (Oct3/4, NESTIN, PAX6, SOX1, β-III-tubulin) by immunocytochemistry. We were able to obtain heterogeneous cultures that presented immunoreactivity for NESTIN, PAX6, SOX1 and β-III-tubulin, with high number of positive cells for PAX6 and SOX1. We found a statistically significant lower numbers of SOX1 positive cells in MJD cultures compared to controls at the end of neural induction. These NPCs can be used as powerful tools to develop relevant patients’ iPSCs-derived neuronal models for a deep understanding of the disease and to develop a MTS assays, allowing drug discovery for MJD disease.

A doença de Machado Joseph (DMJ), ou ataxia espinocerebelosa tipo 3, é a ataxia hereditária dominante mais comum em todo o mundo, apresentando a sua maior prevalência (1:239) no arquipélago dos Açores, Portugal.A DMJ é causada por uma expansão anormal do trinucleótido CAG no gene ATXN3, gerando uma forma mutante da proteína ATAXINA-3. Isto resulta numa proteína ATAXINA-3 "sobredimensionada", que tende a agregar como inclusões intranucleares nos neurónios, levando à toxicidade e morte celular. Apesar de a DMJ apresentar uma heterogeneidade fenotípica, os doentes geralmente apresentam perda de coordenação motora, dificuldade na fala e na deglutição e movimentos oculares comprometidos, por vezes acompanhados de visão dupla ou olhos inchados. A DMJ é muito incapacitante e leva à morte prematura, sendo a terapia sintomática a única abordagem disponível. Assim, existe uma enorme procura de novas estratégias terapêuticas capazes de parar ou atrasar a progressão da doença.As células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC) humanas têm demonstrado um grande potencial para a modelação de doenças, uma vez que partilham o fundo genético do doente de que derivam. Devido à sua pluripotência, podem ser diferenciadas em tipos específicos de células somáticas como, por exemplo, as células neuronais. Estas são particularmente adequadas para a descoberta de medicamentos para doenças neurológicas, ultrapassando as limitações relativas ao acesso a tecido cerebral humano.Com o objetivo final de identificar indicadores fenotípicos relevantes para o desenvolvimento de um ensaio de Medium-Throughput Screening (MTS) para o teste de fármacos utilizando culturas neuronais derivadas de iPSCs de doentes com DMJ, gerámos, caracterizámos e colocámos no biobanco linhas de células progenitoras neurais (NPCs) de controlos saudáveis e de doentes com DMJ. Utilizámos um protocolo simples e curto de indução neural em monocamada para obter culturas de NPC. As NPCs foram então caracterizadas através da avaliação de marcadores específicos de células estaminais, células progenitoras neurais e células neuronais (Oct3/4, NESTINA, PAX6, SOX1, β-III-tubulina) por imunocitoquímica. Foi possível obter culturas heterogéneas que apresentaram imunorreactividade para NESTINA, PAX6, SOX1 e β-III-tubulina, com um elevado número de células positivas para PAX6 e SOX1. Descobrimos um menor número, estatisticamente significativo, de células positivas para SOX1 nas culturas de DMJ em comparação com os controlos no final da indução neural. Estas NPCs podem ser utilizadas como ferramentas poderosas para desenvolver modelos neuronais derivados de iPSCs de doentes, relevantes para uma compreensão profunda da doença e para desenvolver ensaios de MTS, permitindo a descoberta de medicamentos para a doença de DMJ.

Outro - European Regional Development Fund (ERDF), through the Centro 2020 Regional Operational Program; through the COMPETE 2020 – Operational Programme for Competitiveness and Internationalization, and Portuguese national funds via FCT under the projects: UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, LA/P/0058/2020, SpreadSilencing (POCI-01-0145-FEDER029716), ViraVector (CENTRO-01-0145-FEDER 022095), Fighting Sars-CoV-2 (CENTRO-01-01D2- FEDER-000002), BDforMJD (CENTRO 01-0145-FEDER-181240 and 2022.06118.PTDC), ModelPolyQ2.0 (CENTRO-01- 0145- FEDER-181258), and MJDEDIT (CENTRO-01-0145-FEDER-181266); ARDAT under the IMI2 JUgrant agreement no. 945473 supported by the European Union's H2020 programme and EFPIA; by the National Ataxia Foundation (US), the American Portuguese Biomedical Research Fund (APBRF) and the Richard Chin and Lily Lock Machado-Joseph Disease Research.