Cell type-specific drivers to study the Dilp8-sensitive neuroendocrine circuit

Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia

Os órgãos dos animais coordenam o seu crescimento através de programas autónomos e não autónomos, que juntos originam adultos com órgãos de tamanho e proporção típicos da espécie. A capacidade dos animais de recorrerem a este programa de desenvolvimento, mesmo encarando graves perturbações ambientais e/ou de desenvolvimento, é chamada estabilidade do desenvolvimento. Em Drosophila, Dilp8, um péptido tipo-insulina, medeia a coordenação do desenvolvimento inter-orgão durante o desenvolvimento larval. Dilp8 é produzido sempre que ocorre crescimento anormal nos tecidos epiteliais periféricos (discos imaginais) em larvas em desenvolvimento. A atividade de Dilp8 induz um atraso no começo da metamorfose por ser antagonista da via de sinalização da ecdisona, indutora da metamorfose. Portanto a atividade de Dilp8 proporciona tempo adicional para o desenvolvimento larval de forma a compensar o crescimento dos tecidos a crescer irregularmente, promovendo a estabilidade do desenvolvimento. Tem-se descrito que Dilp8 atua no SNC através de um novo circuito neuronal que inclui dois interneurónios bilaterais (neurónios PIL) que expressam Lgr3, uma proteína conservada tipo-recetor de relaxina. Como Dilp8, Lgr3 é essencial para prevenir a variabilidade no desenvolvimento. Foi colocada a hipótese de que os neurónios PIL são essenciais para mediar a resposta, dependente de Lgr3, ao sinal de stress Dilp8. O modelo proposto é que o sinal periférico Dilp8 ativa o recetor Lgr3 expresso nos interneurónios PIL. Isto induz um aumento na sinalização de cAMP e a atividade dos neurónios PIL, o que leva ao atraso na biossíntese de ecdisona pela glândula anelar e por consequência um atraso no começo da metamorfose. O principal objetivo desta tese é testar este modelo, caracterizando elementos regulatórios (ERs) específicos para os neurónios PIL ao usar quatro estratégias distintas: 1) dissecar um elemento regulatório, com capacidade de regular a expressão nos neurónios PIL, previamente testado (R19B09>); 2) procurar pelo menos quatro ERs genéticos que levam à expressão nos neurónios PIL, para integrar o Versatile Entry Code (VEnCode) especifico para os neurónios PIL, recorrendo a uma nova estratégia de GAL4 dividido em 4 (4x-split VEnC-GAL4); 3) usar estes ERs para conduzir a expressão genética de neurónios PIL baseados no Split-GAL4; e 4) usar estratégias de interseção Flp-out mediadas por recombinação para manipular os neurónios PIL usando os ERs MZ699> e RB19B09> (MZ699 ∩ RB19B09>). Usando as estratégias 1 e 2 obtivemos quatro elementos, R19B09.3A, R19B09.3C, R29B09 e R25E10, em que todos levam à expressão nos neurónios PIL e são usados para o desenvolvimento de condutores de expressão genética nos neurónios PIL, baseados no VEnCode ou no Split-GAL4. Ao remover Lgr3, usando RNAi (Lgr3-IR) ou ativando termogeneticamente neurónios com TrpA1 em subpopulações de células sob o controlo destes ERs ou de outros desenvolvidos na estratégia 4, nós fizemos diversas descobertas que desafiam o modelo atual de funcionamento da via Dilp8-Lgr3: enquanto os nossos resultados sustentam o facto de que Lgr3 é necessário nos neurónios PIL para transmitir o sinal de Dilp8 e atrasar o desenvolvimento, os nossos resultados rejeitam a hipótese de que os neurónios PIL são ativados depois da sinalização de Dilp8. A ativação neuronal termogenética por TrpA1 e o silenciamento neuronal mediado por Kir2.1 das poucas células onde ambos os ERs MZ699 e RB19B09 regulam a expressão genética, sugerindo um novo modelo onde os neurónios PIL têm atividade constitutiva que promove a pupariação, que é temporariamente silenciada em resposta à sinalização Dilp8-Lgr3. Adicionalmente a estes estudos funcionais, nós definimos a neuroanatomia dos neurónios PIL, observando que o par bilateral de neurónios PIL não é idêntico: enquanto ambos revelam projeções ipsilaterais e contralaterais para a maioria dos compartimentos anterior-dorsal do neurópilo, um dos neurónios PIL bilaterais revela projeções ipsilaterais para a zona subesofagial, enquanto que o outro não. Por ultimo, ao explorar uma seleção com base em imagiologia para os ERs que hipoteticamente conduzem expressão genética nos neurónios PIL, nós descobrimos novas populações celulares, caracterizadas pelos ERs R48H10> e R69F02>, que induzem um atraso na pupariação após ativação termogenética por TrpA1. Nós não encontrámos evidencias de que estas células atuam na via Dilp8-Lgr3, mas é possível que atuem a jusante dos neurónios PIL. Nós descobrimos populações restritas de células R19B09 e R69F02 resistentes a elav-GAL80 que causam um atraso na pupariação após ativação por TrpA1. No final desta tese proponho um modelo revisto de como a via Dilp8-Lgr3 atua para promover a estabilidade do desenvolvimento, o que no futuro poderá ser estudado usando os novos ERs de neurónios PIL baseados no VEnCode e no Split-GAL4, ao qual os resultados deste trabalho permitem dar continuidade.

Body organs of animals coordinate their growth through autonomous and non-autonomous programs, which together produce individuals with organs of a size and proportion typical of a species. The ability of animals to achieve this developmental program even in the face of severe developmental and/or environmental perturbations is termed developmental stability. In Drosophila, an insulin-like peptide, Dilp8, mediates interorgan growth coordination during larval development. Dilp8 is produced whenever abnormal growth occurs in peripheral epithelial tissues (imaginal discs) of developing larvae. Dilp8 activity induces a delay in the onset of metamorphosis by antagonizing the metamorphosis-inducing ecdysone signalling pathway, providing extra time for the developing larvae to compensate for the growth of abnormally growing tissues, promoting developmental stability. This Dilp8 activity is absolutely dependent on the presence of a conserved relaxin receptor-like protein, Lgr3, in the larval CNS. Two bilateral brain interneurons, named pars intercerebralis Lgr3-positive (PIL) neurons, have been hypothesized to be the critical neurons mediating the Lgr3-dependent response to the Dilp8 peripheral tissue stress signal. The model is that the Dilp8 signal activates Lgr3 receptor expressed in the PIL neurons. This leads to an increase in cAMP signalling and PIL neuron activation, which somehow leads to a delay in the biosynthesis of ecdysone by the ring gland and a consequential delay in the onset of metamorphosis. The main aim of this thesis is to test this model by generating PIL neuron-specific genetic drivers. For this, we used four different strategies: 1) genetic dissection of a regulatory element previously shown to drive expression in PIL neurons (RB19B09>); 2) searching for at least four independent sparse gene drivers that drive expression in PIL neurons to constitute a Versatile Entry Code (VEnCode) for PIL neurons in order to generate an exquisitely-specific VEnCode-based PIL neuron driver based on a new quadruply-split GAL4 (4x-split VEnC-GAL4); 3) using these REs to generate Split GAL4-based PIL neuron drivers; and 4) using recombinase-mediated Flp-out intersectional strategies to manipulate PIL neurons using the MZ699> and RB19B09> drivers (MZ699 ∩ RB19B09>). With strategy 1 and 2 we obtained four elements, R19B09.3A, R19B09.3C, R29B09 and R25E10, all of which drive expression in PIL neurons and are being used to develop VEnCode- or Split GAL4-based drivers for PIL neurons. By removing Lgr3 using RNAi (Lgr3-IR) or thermogenetically activating neurons with TrpA1 in subpopulations of cells under the control of these and other drivers developed in strategy 4, I made a series of key findings that challenge the current model of how the Dilp8-Lgr3 pathway works: while the data still support the fact that Lgr3 is required in PIL neurons to convey the Dilp8 peripheral stress signal and delay development, I gathered enough evidence to reject the hypothesis that PIL neurons are activated following Dilp8 signalling. Rather, TrpA1 thermogenetic neuronal activation and Kir2.1-mediated neuronal silencing of the few MZ699 ∩ RB19B09>-expressing cells, suggest a model where PIL neurons have a constitutive activity that promotes pupariation, which is temporarily silenced upon Dilp8-Lgr3 signalling. In addition to these functional studies, I further defined PIL neuron neuroanatomy, observing that the bilateral pairs of PIL neurons are not identical: while both send ipsilateral and contralateral projections to the anterior-dorsal most compartments of the neuropil, only one of the bilateral PIL neuron sends ipsilateral projections towards the subesophageal zone. Finally, by exploring an imaging-based screen for drivers putatively driving expression in PIL neurons, I discovered novel cell populations, characterized by the drivers R48H10> and R69F02>, which induce a delay in pupariation upon TrpA1 thermogenetic activation. I found no evidence that any of these cells act in the Dilp8-Lgr3 pathway, but it is possible that they might act downstream of PIL neurons. I also found a restricted population of elav-GAL80 resistant R19B09> and R69F02>-expressing cells that cause a delay in pupariation upon TrpA1 thermogenetic activation. I end my thesis by proposing a revised model of how the Dilp8-Lgr3 pathway works to promote developmental stability, which hopefully could be tested with the new VEnCode- and Split GAL4-based PIL neuron drivers that my work opens up the possibility to develop.

Outro - Financimento obtido pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia com o projeto PTDC/BEX-BCM/1370/2014, denominado: Interorgan communication during growth perturbation.