Impact of human iPSC-derived NESC transplantation in MJD-associated neuropathology and motor impairments

Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia

A doença de Machado-Joseph (DMJ) é uma doença neurodegenerativa autossómica dominante. A DMJ surge de uma expansão anormal do trinucleótido CAG no gene ATXN3, resultando na expansão de poliglutaminas na proteína ataxina-3. Esta mutação confere um ganho de função tóxico à ataxina-3, estando na base de mecanismos complexos que provocam disfunção e morte celular.Doentes com DMJ apresentam sintomas motores e não motores, associados a alterações neuropatológicas, como presença de agregados de ataxina-3 mutante, perda neuronal e atrofia cerebelar. Atualmente, não existem terapias disponíveis para parar ou retardar a progressão da doença e, geralmente, no momento do diagnóstico, já ocorreu extensa perda neuronal. Portanto, estratégias de terapia celular podem ser necessárias em esquemas terapêuticos eficazes para doentes sintomáticos com a DMJ.A utilização de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC), possibilita a implementação de terapias personalizadas, reprogramando células somáticas do doente em células estaminais para transplante autólogo. As iPSC podem ser induzias em células estaminais neuroepiteliais (NESC) que, após diferenciação, dão origem a células do sistema nervoso.O objetivo principal do presente trabalho foi estabelecer linhas celulares de NESC derivadas de iPSC de doentes com a DMJ, com o mRNA do gene ATXN3 mutante silenciado, e investigar o potencial neuroprotetor destas células após o transplante cerebelar, nomeadamente o seu impacto no fenótipo motor e na neuropatologia associados à DMJ. Para atingir este objetivo, foi entregue às células com lentivírus um shRNA desenhado para silenciar especificamente o mRNA ATXN3 mutante em NESC derivadas de iPSC de doentes com a DMJ. Os nossos resultados demonstram que é possível promover um silenciamento robusto do mRNA ATXN3 mutante em NESC derivadas de iPSC de doentes com DMJ, o que também se traduz numa redução significativa nos níveis da proteína ataxin-3 mutante. Este silenciamento é específico, uma vez que a ataxina-3 wild-type não foi afetada. Além disto, depois do silenciamento génico foi possível estabelecer linhas celulares estáveis que são capazes de originar, após diferenciação in vitro, culturas heterogéneas compostas por neurónios e glia. Em seguida, as células com o ATXN3 mRNA mutante silenciado foram transplantadas no cerebelo de murganhos transgénicos adultos de DMJ, submetidos a imunossupressão com Tacrolimus administrado por pellets de liberação controlada, a fim de avaliar o seu efeito nas alterações da coordenação motora e na neuropatologia associadas à DMJ. Foram observadas melhorias na coordenação motora 5 semanas após o transplante das células, juntamente com um aumento na espessura da camada de células de Purkinje do cerebelo. No entanto, verificámos que a maioria das células não sobreviveu até ao final do estudo. O tratamento com Tacrolimus por si só também melhorou a coordenação motora, na semana 8, e aumentou a espessura da camada de células de Purkinje do cerebelo. Assim sendo, os dados deste estudo piloto indicam que o transplante das células não resulta em melhoria significativa da coordenação motora e neuropatologia, em comparação com murganhos tratados com Tacrolimus. No entanto, mais experiências são necessárias para aumentar o número de animais testados para o efeito do transplante destas células na DMJ e para avaliar se a observada ausência de efeito significativo das células transplantadas é resultado de um problema com o lote de células utilizadas neste estudo. Assim como, para avaliar se a imunossupressão promovida com uso de pellets de liberação controlada é a estratégia mais adequada para promover imunossupressão prolongada e eficiente em murganhos.

Machado-Joseph disease (MJD) is an autosomal, dominantly inherited neurodegenerative disease. MJD arises from an abnormal expansion of the CAG trinucleotide in the ATXN3 gene, leading to the presence of an expanded polyglutamine tract in the ataxin-3 protein. This mutation confers toxic gain-of-function to ataxin-3, underlying complex pathogenic mechanisms that cause cellular dysfunction and death. MJD patients present motor and non-motor symptoms, associated with neuropathological alterations, such as the presence of mutant ataxin-3 aggregates, neuronal loss, and cerebellar atrophy. Presently, there are no therapies available to stop or delay the progression of this disease, and generally, by the time of diagnosis, extensive neuronal loss has already occurred. Therefore, cell replacement may be required in effective therapeutic strategies for MJD symptomatic patients. The use of induced pluripotent stem cells (iPSC), makes possible to implement personalized therapies, reprogramming somatic cells of the patient into stem cells for autologous transplantation. The iPSC can be induced into neuroepithelial stem cells (NESC) that upon differentiation give rise to cells of the nervous system. The present work main goal was to establish mutant ATXN3 mRNA depleted MJD patient´s iPSC-derived NESC cell lines and to investigate the neuroprotective potential of these cells, namely their impact on MJD-associated motor phenotype and neuropathology after cerebellar transplantation. To accomplish this objective, an shRNA to specifically silence mutant ATXN3 mRNA in MJD patient´s iPSC-derived NESC was delivered to cells with lentivirus. Our results demonstrate that it is possible to promote a robust silencing of mutant ATXN3 mRNA in MJD patient´s iPSC-derived NESC, which translates into a significant reduction in the mutant protein as well. This silencing is specific since wild-type ataxin-3 was not affected. Moreover, upon gene silencing it was possible to establish stable cell lines that are able to originate, upon in vitro differentiation, heterogeneous cultures composed by neurons and glia.Then, the silenced mutant ATXN3 cells were transplanted into the cerebellum of adult MJD transgenic mice, submitted to immunosuppression with Tacrolimus delivered by controlled release pellets, in order to evaluate the effect on MJD-associated neuropathology and motor coordination impairments. Improvements in motor coordination performance were observed by week 5 after cells transplantation, along with an increase in the cerebellar Purkinje cells layer thickness. However, we verified that the majority of the cells did not survive until the end of the study. Tacrolimus treatment per se also improved motor coordination performance, by week 8, and increased the cerebellar Purkinje cells layer thickness. Therefore, the data in this pilot study indicate that the transplantation of the cells do not result in a significant improvement of the motor coordination and neuropathology, as compared to Tacrolimus-treated mice. Nevertheless, further experiments are required to increase the number of animals tested for the effect of the transplantation of these cells on MJD and to evaluate whether the observed absence of significant effect of the transplanted cells is a result of a problem with the lot of cells used in this study. As well as, to evaluate whether the immunosuppression promoted using controlled release pellets is the most adequate strategy to promote prolonged and efficient immunosuppression in mice.

Outro - Este trabalho foi financiado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) através do Programa Operacional Regional Centro 2020, através do Programa Operacional Fatores de Competitividade (COMPETE 2020), e por Fundos Nacionais Portugueses através da FCT (Fundação para a Ciência e Tecnologia) - UIDB/04539/2020, PTDC/BTM-ORG/30737/2017 (POCI-01-0145-FEDER-030737), projeto CEECIND/04242/2017, projetos BrainHealth2020 (CENTRO-01-0145-FEDER-000008), |POCI-01-0145-FEDER-016719), SpreadSilencing POCI-01-0145-FEDER-029716, Imagene POCI-01-0145-FEDER-016807, CancelStem POCI-01-0145-FEDER-016390, POCI-01-0145-FEDER-032309, e ainda pela French Muscular Dystrophy Association, the National Ataxia Foundation (USA), and the Richard Chin and Lily Lock Machado-Joseph Disease Research Fund.