Viability, stability and antimicrobial susceptibility studies of a “next generation probiotic” : faecalibacterium prausnitzii

Recentemente, a bactéria comensal intestinal Faecalibacterium prausnitzii tem surgido como um forte candidato a probiótico de nova geração, devido ao seu papel promissor no tratamento e prevenção de doenças inflamatórias intestinais. Porém, uma grande barreira no desenvolvimento de produtos alimentares, terapêuticos e nutracêuticos é a sua natureza anaeróbia estrita. Assim, o objetivo principal desta tese foi investigar formulações liofilizadas incorporando prebióticos, antioxidantes e crioprotetores, como uma ferramenta biotecnológica para aumentar a estabilidade e viabilidade de F. prausnitzii durante o armazenamento aeróbio e quando exposto a condições de simulação de trato gastrointestinal. Numa primeira fase, foi executada uma caracterização fenotípica da estirpe F. prausnitzii DSM 17677. A curva de crescimento obtida mostrou que uma segunda subcultura bacteriana, incubada entre 10 a 12 horas, corresponde à fase exponencial da cultura, apresentando valores elevados de células viáveis (8.43 ± 0.04 Log CFU/mL). Pela coloração de Gram e pelas propriedades morfológicas confirmou-se que é um bacilo gram negativo, que forma colónias circulares, convexas e esbranquiçadas. Pela exposição ao oxigénio verificou-se uma elevada inibição do crescimento bacteriano pelo método das placas após 1 minuto de exposição, sendo que pelo método dos tubos contendo suspensão bacteriana a viabilidade foi preservada (7.40 ± 0.13 Log CFU/mL versus controlo inicial de 7.29 ± 0.25 Log CFU/mL). Quando exposta a pH ácido durante 2 horas, uma elevada inibição do crescimento bacteriano foi observada a pH 3, sendo que a pH 5 a viabilidade sofreu pequenas alterações (7.17 ± 0.19 Log CFU/mL) face ao controlo (7.40 ± 0.23 Log CFU/mL). A exposição a sais biliares a diferentes concentrações [0.1 - 0.5 % (m/v)], por 3 horas, revelou uma elevada sensibilidade desta bactéria quando presente nessas condições. Adicionalmente, verificou-se que F. prausnitzii DSM 17677 é resistente à ampicilina, gentamicina, canamicina, estreptomicina e eritromicina, mas suscetível à vancomicina, clindamicina, tetraciclina e cloranfenicol. Após caracterização fenotípica, foram desenvolvidas formulações liofilizadas de forma a aumentar a viabilidade de F. prausnitzii durante o armazenamento aeróbio, resultando numa formulação contendo inulina a 5 % (m/v) com sacarose a 5 % (m/v), cisteína a 0.2 % (m/v) e riboflavina (16.5 mM), que apresentou elevadas taxas de sobrevivência (acima de 65%) e valores aceitáveis de células viáveis (> 4.5 Log CFU/g) durante 4 dias de armazenamento aeróbio à temperatura ambiente. Contudo, ao expor esta formulação a pH ácido e sais biliares verificou-se que não ofereceu proteção adicional face à exposição utilizando apenas bactéria sem formulação.

The gut commensal bacterium Faecalibacterium prausnitzii has been recognized as a next generation probiotic candidate due to its promising outcomes in the treatment and prevention of intestinal inflammatory diseases. However, its strict anaerobic nature is a hurdle in the development of foods, nutraceutical or therapeutic products incorporating this novel bacterium. Therefore, the main objective of this thesis was to explore freeze-dried formulations containing prebiotic, cryoprotectant and antioxidant agents as a biotechnological strategy to enhance F. prausnitzii viability and stability under aerobic storage and when subjected to harsh gastrointestinal tract conditions. Firstly, a comprehensive phenotypic characterization involving the F. prausnitzii DSM 17677 strain was performed. The growth kinetics revealed that a second bacterial subculture with 10- 12 hours of incubation time corresponds to a bacterial culture in the exponential phase with high viable cells numbers (8.43 ± 0.04 Log CFU/mL). The gram staining and morphological traits confirmed this strain is a gram-negative rod, forming milky white, convex and circular colonies. Exposure to ambient air revealed a high inhibition (< LOD) of bacterial viability when exposing inoculated plates for 1 minute, while as a bacterial suspension within tubes in the presence of oxygen, their viability was preserved (7.40 ± 0.13 Log CFU/mL versus initial control of 7.29 ± 0.25 Log CFU/mL). Upon exposure to acidic pH for 2 hours, a high inhibition of bacterial viability was observed at pH 3 while at pH 5 the viability only underwent slight fluctuations (7.40 ± 0.23 Log CFU/mL for control versus 7.17 ± 0.19 Log CFU/mL for pH 5 exposure). A high sensitivity of F. prausnitzii DSM 17677 when exposed to bile at different concentrations [0.1-0.5 % (m/v)] for 3 hours was also verified. In addition, the antimicrobial susceptibility testing revealed the resistance of F. prausnitzii to ampicillin, gentamicin, kanamycin, streptomycin and erythromycin and susceptibility to vancomycin, clindamycin, tetracycline and chloramphenicol. After phenotypic characterization, freeze dried formulations to increase F. prausnitzii viability during aerobic storage were developed, with formulation containing inulin at 5% (m/v), sucrose at 5% (m/v), cysteine at 0.2% (m/v) and riboflavin (16.5 mM) showing survival rates higher than 65 % and acceptable viable cell numbers (> 4.5 Log CFU/g) during 4 days of aerobic storage at room temperature. However, when this formulation was exposed to bile and acidic pHs, no further protection was granted in comparison to non-formulated bacteria.