Role of Tropomyosin2 in cell proliferation and survival of Drosophila melanogaster

Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016

O citoesqueleto de actina é responsável por um grande número de processos celulares, tais como a forma e a mobilidade celular, o transporte intracelular, a citocinese. Este também traduz forças mecânicas exteriores à célula em sinalização bioquímica, modulando a expressão genética. O citoesqueleto de actina é formado por filamentos de actina (F-actina) que por sua vez são compostos por monómeros de actina globular (G-actina) e é a organização destes filamentos em arquitecturas especializadas e distintas que definem as propriedades mecânicas destas. A organização e função de diferentes arquiteturas de F-actina depende da interação e ligação destas com proteínas especializadas, as actin binding proteins – ABPs que estão divididas em famílias consoante a sua função. Estas proteínas ao interagirem com a F-actina, levam à formação de redes de F-actina distintas e especializadas. Uma família particular de ABPs são as Tropomiosinas. As Tropomiosinas são uma família conservada à qual é atribuída um papel fundamental na regulação funcional de filamentos de actina em células musculares e não-musculares. As proteínas desta família regulam uma larga variedade de funcionalidades do citoesqueleto ao recrutar, de modo específico, outras ABPs para a F-actina. Os mamíferos possuem quatro genes de Tropomiosina – TPM1, TPM2, TPM3 e TPM4 – que, dão origem a mais de 40 isoformas através de splicing alternativo, mas apenas metade destas estão confirmadas. Estas isoformas são normalmente divididas em duas categorias, segundo o seu peso molecular: as high molecular weight (HMW) e as low molecular weight (LMW). A Drosophila melanogaster possui apenas dois genes de Tropomiosina – tm1 e tm2. A tm2 dá origem à isoforma Tm2-A/B e à isoforma Tm2-C. Ao regular a funcionalidade do citoesqueleto, as Tropomiosinas tornam-se essenciais ao correto funcionamento celular. A sua importância, leva a que as Tropomiosinas estejam associadas a várias patologias humanas, uma das quais o cancro. Na verdade, diversos estudos já correlacionaram alterações na expressão genética de Tropomiosinas com fenótipos em células cancerígenas. Curiosamente, os mesmos estudos encontraram que existem isoformas especificas que se encontram altamente expressas em células cancerígenas, enquanto outras isoformas se encontram silenciadas. Num estudo de microarray para ABPs desreguladas numa linha celular com transformação induzível, bem como em amostras tumorais de pacientes humanos, o Laboratório Actin Dynamics identificou que a TPM2 se encontrava sub-expressa em ambos os casos. Em Drosophila, a tm2 mostrou ser necessária para prevenir o crescimento excessivo em discos imaginais de asa. Estas observações sugerem que a tm2 pode ter um papel em restringir a proliferação celular, tal como acontece em Tropomiosinas HMW humanas. Para além disso, a proliferação celular desregulada e excessiva é uma das principais características em tumores. Um dos muitos papeis do citoesqueleto de actina passa por regular o crescimento de tecidos e órgãos através da via de sinalização de supressão de tumores Hippo. Esta via de sinalização é constituída por uma cascata de cinases composta por Hippo (Hpo), Salvador (Sav), Mob as Tumor Supressor (Mats) e Warts (Wts). Hpo fosforila Wts, que por sua vez fosforila e inativa Yorkie (Yki). Yki é um cofator de transcrição cuja atividade leva à expressão de genes de proliferação e anti-apoptose, levando assim ao crescimento de tecidos e órgãos. Deste modo, quando a via de sinalização Hippo não está ativa, Yki está no núcleo a promover a proliferação celular e a sobrevivência. Quando a via Hippo está ativa, Wts fosforila Yki e impede este de entrar no núcleo e levar a expressão dos seus genes-alvo. Visto que o citoesqueleto regula a atividade desta via de sinalização e que as Tropomiosinas regulam a funcionalidade do citoesqueleto, existe a possibilidade de tm2 restrinja o crescimento de tecidos por regular a atividade da via de sinalização Hippo. Assim, o presente estudo pretende validar o papel da tm2 no crescimento de discos imaginais de asa de Drosophila tal como averiguar se a restrição do crescimento se faz através da via de sinalização Hippo. De modo a validar o papel que a tm2 tem em limitar o crescimento em discos imaginais de asa e em asas adultas, foram utilizadas duas linhas de moscas com transgenes que expressam RNAi: a linha tm2-IRJF01095 e a linha tm2-IRHMS02260. Os resultados parecem indicar que a sub-expressão de tm2 levou a um aumento significativo no tamanho do domínio distal do disco de asa e de asas adultas. Surpreendentemente, o crescimento excessivo em discos que sub-expressam tm2 não foi igual em todos os discos, levantando assim a possibilidade da tm2 apenas contribuir para a restrição do crescimento no fim do desenvolvimento do disco, quando este para de crescer. Assim, a tm2 restringe o crescimento excessivo na asa. Adicionalmente, quando a sub-expressão de tm2 leva a crescimento excessivo, este é acompanhado de um aumento nos níveis de F-actina, mas quando não há crescimento excessivo existe um decréscimo nos níveis de F-actina. A sub-expressão de tm2 também levou ao aumento do nível de expanded, four-jointed e Wingless, todos genes-alvo da atividade de Yki, indicando assim que tm2 contribui para limitar a expressão de alvos transcricionais de Yki. Para além destes resultados, também foi feita uma comparação entre os genes de Tropomiosina humanos e de Drosophila. Nesta análise foram comparados os exões codificantes de todos os genes humanos (TPM1, TPM2, TPM3 e TPM4) com cada exão dos genes de Drosophila (tm1 e tm2). Esta análise permitiu verificar que as isoformas de tm2 parecem ser mais comparáveis às Tropomiosinas humanas HMW do que às LMW. Estes resultados parecem sugerir que a tm2 pode ser responsável por restringir o crescimento excessivo no disco de asa de Drosophila. Adicionalmente, parece também haver um efeito oposto no que toca à regulação dos níveis de F-actina entre as duas isoformas da tm2, a Tm2-A/B e a Tm2-C. Este efeito provavelmente é devido a uma regulação diferencial de ABPs e o facto de haver efeitos opostos vai de encontro a estudos prévios que constataram que diferentes isoformas do mesmo gene de Tropomiosina podem ter efeitos distintos na regulação de ABPs. No entanto, é provável que o papel que a isoforma Tm2-A/B tem em prevenir a acumulação excessiva de F-actina e em regular o crescimento da asa estejam ligados, o que vai de encontro com o facto de que o citoesqueleto de actina regula a atividade da via de sinalização Hippo. Para além disso, a Tm2-A/B parece ter um papel em regular a atividade transcricional de Yki. Assim, uma rede de F-actina definida pela presença de Tm2-A/B poderá receber informação exterior e levando à regulação da via de sinalização Hippo de modo a controlar a atividade transcricional de Yki, parando assim o crescimento no fim do desenvolvimento do disco de asa de Drosophila. Tendo em conta que um dos papeis centrais do citoesqueleto de actina é mediar e contribuir para a geração de forças mecânicas no ambiente celular, estas mesmas forças poderão ser persentidas pela rede de F-actina contendo Tm2-A/B e traduzidas em regulação da atividade da via de sinalização Hippo. Deste modo, quando o disco imaginal da asa se encontra a desenvolver, esta rede de F-actina não afeta o crescimento e a via de sinalização Hippo está inativa, permitindo assim que os tecidos cresçam. Mais tarde, à medida que os tecidos crescem, existe uma acumulação de forças compressivas que são persentidas pela rede de F-actina que contém Tm2-A/B, ativando assim a via de sinalização Hippo e consequente cessar do crescimento.

The Actin cytoskeleton is a vital cell component that controls a large number of cellular processes, including cell shape, mobility and intracellular transport. The cytoskeleton also transmits external forces into signaling activity, such as Hippo pathway signaling, which controls tissue growth and cell fate decision during development and adult homeostasis. Tropomyosins belong to a highly conserved and diverse family of actin-binding proteins (ABPs), which stabilize and regulate the functional diversity of actin filaments, by mediating their interaction with other ABPs Additionally, Tropomyosins contribute to tumorigenesis, though the mechanisms remain unclear. In our lab, Tropomyosin2 (tm2) was identified as an ABP that seems to restrict Drosophila wing imaginal disc growth. This presented the opportunity to further investigate if tm2 restricts wing disc growth and to identify if the underlying mechanism could be Hippo pathway activity regulation. tm2 downregulation promotes larval wing disc and adult wing overgrowth. The solicited overgrowth displayed phenotypic variability, from no apparent overgrowth to heavily affected tissue size and morphology. The effect of tm2 downregulation on F-actin levels also seems to be linked to this phenotypic penetrance effect as discs with no overgrowth appeared to have less actin while those with overgrowth had F-actin accumulation. Moreover, when tm2 downregulation induced tissue overgrowth, there is upregulation of Hippo target genes. Taken together, these observations suggest that tm2 could be necessary to prevent wing disc overgrowth by regulating F-actin levels and Hippo pathway activity. In Drosophila, Tropomyosin had yet to be linked to tissue growth, which suggests a novel regulatory function of tm2 in vivo and while the actin cytoskeleton is known to regulate Hippo pathway activity, this work present novel evidences for a possible role of Tropomyosins intervening in this regulation. Finally, I hypothesize that tm2 could be necessary to translate external cues, such as mechanical force, into wing disc growth termination by triggering Hippo pathway activity.