Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos em lamas: validação do método de análise por ASE-HPLC-FLD-DAD

Tese de mestrado, Controlo de Qualidade e Toxicologia dos Alimentos, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017

O principal objetivo do trabalho foi o desenvolvimento e validação de um método cromatográfico, cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) acoplada a um detetor de fluorescência (FLD) e de arranjo de díodos (DAD), para a análise de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP) em lamas de estações de tratamento de águas residuais (ETAR), após extração e concentração por extração acelerada por solvente (ASE). No âmbito deste trabalho fez-se um enquadramento legal relacionado com a valorização agrícola de lamas e delinearam-se as condições experimentais, de forma a cumprir o limite legal, descrito no decreto-lei nº276/2009 (1), de 6 mg/kg em matéria seca, para a soma dos 16 HAP. Este trabalho teve como ponto de partida a otimização dos comprimentos de onda dos detetores de fluorescência e de díodos. A estabilidade do equipamento e das soluções padrão, assim como a eficácia da filtração das soluções foram avaliadas, com base em ensaios de precisão e exatidão. A validação do método analítico englobou a otimização das condições de concentração no evaporador Turbovap e na ASE, determinação do intervalo de linearidade, gama de trabalho, limiares analíticos, precisão e exatidão do método instrumental (HPLC-FLD-DAD) e, limiares analíticos, precisão e exatidão do método global (ASE-HPLC-FLD-DAD). O método de HPLC-FLD-DAD é linear para a análise dos 16 HAP, na gama de concentrações entre 0,050 e 40 μg/L, com coeficientes de determinação (r2) superiores a 0,9970 e coeficientes de variação do método (CVm) inferiores a 5%. As gamas de trabalho diferiram entre cada HAP e variaram entre 0,05 – 40 μg/L. Os limiares analíticos, limite de deteção (LOD) e de quantificação (LOQ) do método instrumental foram determinados em condições de repetibilidade e variaram entre 0,011 a 1,1 μg/L e 0,037 a 3,6 μg/L, respetivamente. A eficiência de concentração no evaporador Turbovap é maior para o diclorometano e a 49 ºC, com recuperações acima dos 75% e desvios-padrão relativos inferiores a 10% para todos os HAP. Na ASE, as melhores condições de operação foram obtidas no modo fluxo (fluxo: 1mL/min; temperatura: 100ºC; ciclo estático: 5 minutos). Os limiares analíticos do método global, limite mínimo de deteção (MDL) e limite mínimo de quantificação (MQL) de cada HAP, variaram entre 0,0030 a 0,75 μg/kg, em matéria seca e 0,0090 a 2,4 μg/kg, em matéria seca, respetivamente. O MQL para a soma dos 16 HAP é de 6,3 μg/kg de matéria seca. A precisão instrumental foi avaliada em condições de repetibilidade e precisão intermédia e, em ambos os ensaios, foram obtidos desvios-padrão relativos inferiores a 19% para todos os HAP. A precisão do método global foi avaliada em condições de repetibilidade e obtiveram-se desvios-padrão relativos entre 10% e 30%. O método HPLC-FLD-DAD é exato com erros relativos inferiores ao critério de aceitação de 20%, para todos os HAP. A exatidão do método global foi avaliada com materiais de referência certificados e os resultados foram avaliados em termos de recuperações obtidas. Para os 16 HAP as recuperações variaram entre 6,9% e 111% com desvio-padrão relativos entre 3,0% e 13%. Apenas 50% dos HAP apresentam recuperações no intervalo de 80% - 120%, logo o método é exato para oito dos HAP em estudo. A incerteza expandida variou entre 15,2% e 56,6%, indicando que o método é exato para os 16 HAP. No conjunto de 15 amostras analisadas, apenas 6,7% das lamas não cumpriram o limite legal de 6 mg/kg, em matéria seca, para a soma dos 16 HAP. Esta amostra apresentou uma concentração de 23,5 mg HAP/kg em matéria seca.

This work aims to develop and validate an analytical method for the analysis of 16 polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in sewage sludge using accelerated solvent extraction (ASE) coupled to the high performance liquid chromatography with fluorescence and diode array detectors (HPLC-FLD-DAD). An overview about legal framework related to the agricultural valorization of sludge was made, and the experimental conditions were established, in order to comply with the legal limit for the sum of 16 PAH (6 mg/kg in dry matter). The optimization of the analytical method was started with the study of chromatographic conditions, in particular wavelengths optimisation of fluorescence and diode array detectors. The instrumental and standard solutions stability and the efficiency of a filtration step were also tested based on precision and accurate assays. The validation studies included an optimisation of Turbovap and ASE conditions, linearity and working range, analytical limits, precision and accuracy. The analytical limits, precision and accuracy of HPLC-FLD-DAD were determined. The determinations were also performed for the global method (ASE-HPLC-FLD-DAD). The instrumental method (HPLC-FLD-DAD) is linear for the analysis of 16 PAH in the working range determined, with determination coefficients (r2) bigger than 0,997 and coefficients of variation lower than 5%. The working range were different for each PAH and they varied between 0.05 – 40 μg/L. The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were defined in repeatability and reproducibility conditions and they varied between 0.011 – 1.1 μg/L (LOD) and 0.037 – 3.6 μg/L (LOQ). The Turbovap concentration efficiency was better for dichloromethane (DCM) and 49 ºC with recoveries higher than 75%, with relative standard deviations (RSD, %) lower than 10% for all of 16 PAH. The best recoveries in ASE were achieved with the flow mode of extraction (flow: 1 mL/min: temperature: 100 ºC, static cycle: 5 minutes). The recoveries varied between 6.9% and 111% with RSD lower than 13%. HPLC-FLD-DAD precision was tested in repeatability and reproducibility conditions and in both cases the obtained RSD were lower than 19% for all of 16 PAH. The ASE-HPLC-FLD-DAD precision was tested in repeatability conditions and the RSD varied between 10% e 30%. The instrumental method is accurate with RSD lower than acceptance criteria of 20% for all of 16 PAH. The minimum detection (MDL) and quantification (MQL) limits varied between 0.0030 – 0.75 μg/kg in dry matter (MDL) and 0.0090 – 2.4 μg/kg in dry matter (MQL). For the sum of 16 PAH the MDL and MQL were 1.9 μg/kg in dry matter and 6.3 μg/kg in dry matter, respectively. ASE-HPLC-FLD-DAD accuracy was evaluated with certified reference materials (CRM). All PAH showed recoveries between 6.9% e 111% with RSD between 3.0% and 13%. 50% of 16 PAH showed recoveries in order of 100 ± 20%. Therefore, the ASE-HPLC-FLD-DAD method is accurate for these compounds. The relative expanded uncertainty varied between 15.2% e 56.6%. The ASE-HPLC-FLD-DAD method is accurate for this 8 HAP. Fifteen sewage sludge samples from wastewater treatment plant (WWTP) were analysed and only 6.7% of them showed PAHs concentrations above the legal limit of 6 mg/kg in dry matter. This sample showed a concentration of 23.5 mg PAH/kg in dry matter.

Laboratórios e Controlo da Qualidade da Água, EPAL