Production of recombinant bovine chymosin for cheese making by Lactococcus lactis LMG 19460 strain

Tese de Mestrado, Microbiologia Aplicada, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências

Milk clotting enzymes have been used for a long time as one of the oldest enzymatic applications. These enzymes can turn milk into cheese, being extracted from animals, plants, fungi or microbially produced. One of the first to be used was the bovine chymosin obtained from the abomasa of suckling calf which enables cheese production by cutting the Phe105 and Met106 ligation in k-casein. Through time and population evolution, the demand for cheese production increased and other methods of producing and extracting chymosin were developed. Chymosin started being produced in bacteria for easier, faster growth and purification. Other enzymes started being deemed as important such as camel chymosin for its high specificity for k-casein. This works’ objectives were thus to produce recombinant bovine and camel chymosin in Lactococcus lactis LMG 19460. Purification of these enzymes would be easier in this model organism since L. lactis have no LPS (lipopolysaccharides), facilitating secretion. The first step of this work involved cloning in Escherichia coli all the necessary components for the enzyme production in pTRKH3/-b plasmids, which include ldh promoter, epr and usp45 signal peptides and, lastly, the bovine and camel chymosin genes with a histidine tag. Upon completion of the clones, L. lactis was transformed with the plasmids and the enzyme production asserted. Transformation of only one construct (pTRKH3-bldh-bCymE-His) was confirmed. However, through SDS-PAGE analysis, bovine chymosin appeared not to be exported, while its presence in cell extracts, from overnight growth, was confirmed by a band of approximately 35 kDa. Two tests followed. Milk clotting test did not have very good results, though the fluorescence assay shows promise. It confirmed the activity and specificity of the enzyme towards k-casein. Future steps include transformation with remaining plasmids containing usp45 or camel chymosin to uncover new and interesting results on the matter.

O leite e os seus derivados como o queijo são produtos altamente consumidos mundialmente e que já existem há muito tempo. A formação do queijo resulta da atividade metabólica de bactérias GRAS (Generally Recognized as Safe) que produzem compostos como ácido lático e modificadores de gosto e aroma. Deste grupo de bactérias, as lácticas não só produzem estes compostos, como exportam enzimas que têm as mais variadas funções. Há cerca de 8000 anos atrás, o uso de enzimas coagulantes do leite (em forma de coalho) começou a ser muito prevalente em populações que deixaram o nomadismo por locais mais estáveis, começando a praticar agricultura e pecuária, tendo em vista a subsistência. Os primeiros animais usados na produção de queijo começaram por ser os bovinos e caprinos, cuja enzima, a quimosina, poderia ser removida dos seus estômagos, principalmente nas crias que ainda mamavam. A quimosina é o enzima que transforma o leite em queijo. Este processo de coagulação tem três passos: o primeiro consiste na degradação enzimática da k-caseína, seguindo-se a floculação micelar e, por fim, a formação do gel. As quimosinas são aspartil proteases que hidrolisam a k-caseína do leite, atacando as ligações Phe105 e Met106. Ocorre, depois, uma destabilização das ligações das moléculas de caseína, libertando-se dois péptidos, um péptido solúvel, o glicomacropéptido e um péptido insolúvel, a para-k-caseína. Este último, agrega-se a outras proteínas formando um gel que originará o queijo. Com o aumento populacional e aumento da demanda de queijo, o método tradicional de recolha de coalho (que contém a quimosina) do estômago dos animais tornou-se mais prejudicial que prático. Então, a mudança de perspetiva passou por mudar tanto a fonte da enzima (por exemplo, de plantas, fungos, microrganismos), como a produção da enzima recombinante em organismos geneticamente modificados (OGM). O advento dos OGM criou um novo leque de oportunidades para dar novas e variadas respostas a este problema. Surgiu assim a primeira produção da quimosina de bovino em E. coli. Provou-se estar ativa e funcional e com poucas ou quase nenhumas mudanças que alterassem o seu funcionamento. Era fundamentalmente igual à quimosina originalmente produzida no bovino. Uma nova competidora aparece neste mercado que é uma quimosina produzida por fermentação com origem no camelo. Esta enzima começou a ganhar relevância. Quando comparada à quimosina do bovino conseguimos ver que o queijo produzido pela mesma apresenta maior tempo de prateleira. Este enzima consegue coagular tanto o leite de vaca como o de camelo enquanto que a variante bovina não consegue coagular o leite do camelo. Pensa-se que é devido à estrutura primária da k-caseína das duas espécies. Foi também reportado que esta enzima tem mais 70% de atividade coaguladora do leite comparada com a variante bovina e menos atividade proteolítica. Devido a estas características esta enzima tornou-se alvo de bastante pesquisa nestes últimos anos. No presente trabalho, o grande objetivo consistia em L. lactis produzir quimosina ativa e com capacidade de ser exportada. Escolheu-se L. lactis por ser um organismo GRAS e por ter um processo de purificação proteico mais simples, pela falta de lipopolissacáridos na membrana. Depois de exportar a enzima, o próximo passo consistia na purificação proteica. Por fim, tendo o enzima purificado seria testar várias características da proteína com o intuito de, no fim, produzir queijo. No entanto, quando o projeto surgiu este não era o principal objetivo. O objetivo inovador no momento discutia a possibilidade de se ter bactérias a produzir e a secretar ativamente a quimosina diretamente no leite. Problemas rapidamente surgiriam, pois, este organismo seria um OGM. Sendo OGM, existia todo um conjunto de legislação que estaria a retardar a possível entrada do mesmo no mercado. Devido a este obstáculo, escolheu-se a alternativa não tão inovadora, mas mais concretizável. Para o efeito, pretendeu-se clonar toda a maquinaria necessária para produzir tanto a quimosina bovina, como a quimosina de camelo, em Lactococcus lactis LMG 19460, usando como vetores os plasmídeos pTRKH3 e pTRKH3-b, sendo este último uma variante com elevado número de cópias. A construção envolve a clonagem de um promotor ldh, as sequências sinal de exportação epr e usp45 de B. subtilis e L. lactis, respetivamente; e, por fim, o gene que codifica a quimosina de bovino ou a de camelo. Nestes passos que envolviam a clonagem dois caminhos eram possíveis. Ou a inserção dos fragmentos desejados era feita usando enzimas de restrição ou usava-se o método de Gibson Assembly, previamente usado e otimizado no laboratório. Para usar tal método, o primeiro passo foi um design de primers específicos que permitissem o sucesso do procedimento e a sua confirmação usando softwares adequados com o APE e o OligoAnalyzer Tool. Um grande obstáculo deste procedimento residia na aleatoriedade da inserção dos fragmentos no esqueleto de pDNA alvo. Apesar de todas as condições estarem reunidas para o procedimento ser sucedido, nem todos os resultados eram positivos. Um exemplo foi na clonagem do péptido sinal usp45 no plasmídeo pTRKH3. Várias tentativas foram realizadas para que a sequencia desejada fosse inserida e a solução para tal dependia do aumento da proporção inserto:plasmídeo. Só com uma proporção de 10:1 (inserto:plasmídeo) é que finalmente a sequencia for inserida com sucesso e o trabalho pôde avançar. O problema não terminou aqui. Na inserção das sequências das quimosinas outro problema surgiu. Apesar de todo o processo fora realizado com sucesso, quando se procedia à sequenciação de Sanger, erros apareciam nas sequências das quimosinas. Exemplos dos erros seriam gaps ou mismatches, erros muito problemáticos pois poderiam invalidar tanto a produção da proteína devido à mutação frameshift ou alteração de aminoácidos chave na sua estrutura que poderia alterar a sua atividade futura. Para facilitar todas estas clonagens, o organismo usado foi E. coli pelo seu rápido crescimento, fácil manipulação e acessibilidade na purificação de pDNA. Após clonagem em E. coli, transformou-se L. lactis com os plasmídeos construídos. Muitas tentativas de transformação foram realizadas alterando vários valores e parâmetros do protocolo, mas apenas um dos plasmídeos foi de facto transformado. O clone de sucesso foi pTRKH3-b-ldh-bCymE-His cuja verificação da presença do plasmídeo foi realizada através da visualização em gel de agarose. De seguida, o próximo objetivo era averiguar se havia produção e secreção da proteína. Após crescer os organismos em meio líquido, separou-se o sobrenadante do conteúdo bacteriano para perceber então a localização da proteína. Primeiro analisou-se o sobrenadante após purificação por IMAC com posterior visualização em SDS-PAGE. Verificou-se assim que a proteína produzida não estava a ser secretada para o exterior. Então, o próximo passo, consistia em investigar o conteúdo celular. As bactérias com crescimento prolongado (1 dia) foram lisadas por sonicação, com posterior purificação usando IMAC (Cromatografia por afinidade), concentração com Amicon (recipientes que permitem a concentração de amostras) e, por fim, visualização em gel SDS-PAGE (géis de analise proteica). A presença da proteína era evidente pelo aparecimento de uma banda com aproximadamente 35 kDa, tamanho esperado da mesma. Em última análise, faltaria assegurar a atividade e especificidade da proteína produzida para caseína. Dois testes foram realizados, um de formação de queijo em pequena escala e outro de fluorescência. Apesar dos testes de coagulação de leite não terem tido os resultados esperados, conseguiu-se perceber que a proteína produzida sozinha não coagulava o leite. Em relação aos testes de fluorescência, mostrou-se que a enzima recombinante é ativa e muito especifica para a caseína, quando comparada com atividade do coalho comercial. Futuramente, pretende-se terminar as construções previstas de plasmídeos recombinantes, seguindo-se a transformação em L. lactis e a análise do perfil de exportação, uma vez que a clonagem do péptido sinal usp45, nativo de L. lactis, poderia garantir a secreção da proteína de interesse. Outra potencial abordagem, seria a edição de genes usando a técnica de CRISPR/Cas9 para melhorar a replicação de plasmídeos e a produção de proteínas. Seria relevante também conseguir produzir e purificar a quimosina de camelo. Se a proteína recombinante for produzida e exportada em maior quantidade, o fabrico de queijo assente na utilização de quimosina recombinante pode, no futuro, ser uma alternativa mais barata, fidedigna e útil aos atuais métodos vigentes.