Retinal erythropoietin distribution and neuroprotective effect in a nanoparticulate drug delivery system after subconjunctival and topical administration in an animal glaucoma model

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na especialidade Clínica

Glaucoma is a neurodegenerative ocular disease with substantial impact in public health, as it causes retinal ganglion cells (RGC) degeneration and irreversible blindness. Neuroprotective strategies have been a focus of research in glaucoma, and the use of erythropoietin and its recombinant forms, like epoetin beta (EPOβ), have shown anti-apoptotic effects on RGC. We aimed to create a nanoformulation carrying EPOβ, adequate for topical ocular administration, that could provide neuroprotection to the retina in cases of glaucoma, with absent or residual secondary effects and the advantage of promoting patients’ compliance to the treatment. Therefore, chitosan and hyaluronic acid (CS/HA) nanoparticles for topical ocular deliver of epoetin beta (EPOβ) were developed, aiming to deliver EPOβ to the retina in a sustained profile. Firstly, in vitro and ex vivo studies of the physicochemical stability, cytotoxicity, release and permeation profiles and mucoadhesive strength of the CS/HA-EPOβ nanoparticles were performed. These nanoparticles allowed EPOβ permeation through ocular membranes in ex vivo assays, with no in vitro cytotoxicity. Afterwards, healthy Wistar Hannover rats were used for subconjunctival and topical administrations of CS/HA-EPOβ nanoparticles, to assess the formulation’s local and systemic influence, its biological tolerance and safety, its effect in retinal electrophysiology, and EPOβ’s distribution in ocular tissues. A sustained EPOβ delivery to the retina was observed using both routes of administration, with no side-effects. Finally, we explored the topical ocular delivery of CS/HA-EPOβ nanoparticles using a rat glaucoma model. We assessed retinal morphological and physiological changes in response to the nanoformulation applied through topical ocular route, using electroretinography and histological evaluation, which comprised immunofluorescence, hematoxylin and eosin staining and apoptosis assessment (cleaved caspase-3). Topical ocular administration of CS/HA EPOβ nanoparticles in glaucomatous rats allowed EPOβ permeation, including by transcorneal pathway, reaching the inner retina. Improvements in retinal electrical activity and thickness, and in apoptosis reduction occurred earlier and more significantly in the treatment group. In conclusion, EPOβ reached the retina, where its neuroprotective action was observed, thus demonstrating the feasibility of topical administration of neuroprotective agents in nanoformulations, targeting the posterior ocular segment. Results were promising and contribute to the development of new therapeutic strategies to preserve the visual acuity of patients with glaucoma or other neurodegenerative ocular diseases

RESUMO - DISTRIBUIÇÃO E EFEITO NEUROPROTETOR DA ERITROPOIETINA NA RETINA APÓS ADMINISTRAÇÃO TÓPICA E SUBCONJUNTIVAL DE UM SISTEMA DE NANOPARTÍCULAS NUM MODELO ANIMAL DE GLAUCOMA - O glaucoma é uma doença ocular neurodegenerativa com impacto substancial na saúde pública, causando degeneração das células ganglionares da retina (CGR) e cegueira irreversível. Várias estratégias neuroprotetoras têm sido estudadas no glaucoma e a epoetina beta (EPOβ), uma forma recombinante da eritropoietina, demonstrou efeitos antiapoptóticos nas CGR. Desta forma, surgiu o interesse em criar uma formulação com EPOβ para administração tópica ocular, com vista a neuroproteção da retina em casos de glaucoma, com o mínimo de efeitos secundários e com a vantagem de promover a adesão dos pacientes ao tratamento. Para tal foram desenvolvidas nanopartículas de quitosano e ácido hialurónico (CS/HA) às quais foi adicionada epoetina beta (EPOβ). Inicialmente, foram realizados estudos in vitro e ex vivo da estabilidade físico-química, citotoxicidade, perfis de libertação e permeação e mucoadesividade das nanopartículas CS/HA-EPOβ. Estas permitiram a permeação de EPOβ em membranas oculares nos ensaios ex vivo, sem citotoxicidade in vitro. Seguidamente, ratos Wistar Hannover saudáveis foram usados para administração subconjuntival e tópica das nanopartículas CS/HA-EPOβ, para avaliar o impacto local e sistémico da formulação, a tolerância biológica e segurança, o efeito na eletrofisiologia da retina e a distribuição da EPOβ nos tecidos oculares. Observou-se uma permeação sustentada de EPOβ até à retina em ambas as vias de administração, sem efeitos adversos. Finalmente, estudámos a via ocular tópica utilizando um modelo experimental de glaucoma em ratos. Avaliámos as alterações morfológicas e fisiológicas da retina em resposta à nanoformulação, através de eletrorretinografia e avaliação histológica por imunofluorescência e coloração de hematoxilina-eosina, e avaliação de apoptose (caspase-3 clivada). A administração tópica ocular de nanopartículas de CS/HA-EPOβ em ratos glaucomatosos permitiu a permeação da EPOβ, inclusive por via transcorneal, até à retina. No grupo de animais tratados ocorreram, mais cedo e de forma mais considerável, melhorias na atividade elétrica e na espessura da retina, e na redução da apoptose. Em suma, a EPOβ chegou à retina, onde foi possível constatar a sua ação neuroprotetora, demonstrando assim a viabilidade da administração tópica de agentes neuroprotetores em nanoformulações, visando o segmento posterior do olho. Os resultados foram promissores e oferecem um contributo significativo para o desenvolvimento de novas formas terapêuticas para preservar a acuidade visual de pacientes com glaucoma ou outras doenças oculares neurodegenerativas