From molecular to tissue-specific roles of Fascin during Drosophila tracheal development: A link between the FGF signalling pathway and the actin-cytoskeleton

How a chemoattractant can act on a tissue to induce its migration towards that source? I have tried to answer this question in this research using as migratory tissue model the Drosophila respiratory organ (trachea) during its embryonic development and studying the role of the actin-bundling protein Fascin (called Singed in Drosophila). The tracheal system has been widely used as a model system for tubulogenesis. The formation of tubules is the main organisation of several organs in vertebrates and invertebrates that are essential for life. They allow the exchange of liquid, gas or nutrients to the corresponding target tissues. Some examples are kidney, mammary gland and vascular system in vertebrates, and in insects the salivary gland or the excretory system. The conserved FGF (Branchless -Bnl- in Drosophila) / FGFR (Breathless -Btl-) signalling pathway plays crucial roles in tracheal formation and, among other processes, it regulates branch migration through the induction of filopodia and motile properties in the leading cells. It has been largely unknown how this pathway triggers the actin-cytoskeleton reorganisation required for filopodia formation and guided migration. Fascins are an evolutionary conserved family of actin-crosslinking proteins responsible for the tight packing of parallel filaments of actin into bundles that compose several cortical cell protrusions. Filopodia are among those protrusions and they typically extend at the cell front of migratory cells to act as guiding sensors and mechanical devices to facilitate guided migration. Fascin is the primary actin crosslinker in filopodia and is essential for their formation. Fascin function has already been associated in different organisms and tissues with cell migration and adhesion. Interestingly, fascin upregulation in several carcinomas is thought to be a key factor in the metastatic process, making our study also relevant in the medical field. In Drosophila an only fascin homolog is encoded, singed (sn). Therefore I decided to test the possibility that Sn is required for tracheal migration, and the possible involvement of the Bnl/Btl pathway in its regulation. In this study I find that the tracheal chemoattractant FGF/Bnl and its pathway induce sn expression in the tracheal system, and that this regulation is functional. The functional analysis of Sn in the tissue lead to the conclusion that Sn is required for several processes mainly related to the leading cells, where Sn is highly accumulated. These cells pull the trailing cells, inducing the migration of the tissue. I specifically find that sn is required in the tissue for: timely and guided migration of the branches, fusion between branches, terminal cell specification, cell extension and terminal lumen guidance. At the cellular level, I find that Sn provides enough stiffness to the filopodia and that it controls the formation of the correct number of filopodia. The rigid filopodia have the necessary strength to push the organized cell front that extends towards the correct place. A molecular analysis shows that Sn regulates the reorganisation of the actin-cytoskeleton of the tracheal cells. These results indicate that Sn acts as a molecular link between the Bnl/Btl signalling pathway and the actin-cytoskeleton driving the migration of the tissue. The fact that Fascin is a target of the FGF/FGFR pathway and that this relationship has a role in cortical extensions and migration, give new insights into the function and regulation of the actin-bundling cytoskeleton during morphogenesis, and provides important information to further understand the involvement of Fascin in metastatic cells, which is relevant in the health field. Moreover I find that the phosphorylation state of Sn is important for the tissue-specific roles of Sn, similarly to bristles and neurons, but in contrast to plasmatocytes or nurse cells. In addition, in this dissertation I show the partnership of Sn with another actin-crosslinker, Forked (F). F is an actin-bundling protein (only similar to the vertebrate Espins located in the actin-bundles of microvilli and stereocilia) so far only reported to act in bristle formation in cooperation with Sn. In this study I show that F is additionally required during the tracheal system development. Specifically F is required for the same processes than Sn. sn and f genetically interact, and both proteins act in concert for the correct formation of tracheal filopodia.

El sistema respiratorio de Drosophila (llamado tráquea) sufre varios procesos morfogenéticos durante su desarrollo embrionario, para dar lugar a un ramificado y continuo árbol de tubos que facilita el intercambio de gases en cada tejido. Muchos de estos procesos se han conservado durante la evolución y son similares a los que tienen lugar durante la formación de otros tejidos de animales superiores compuestos también por tubos (como son el sistema vascular o el riñón de vertebrados). Uno de estos procesos es la migración. Durante el desarrollo traqueal, la cascada de señalización de FGF (Branchless -Bnl- in Drosophila) / FGFR (Breathless -Btl-), también conservada evolutivamente, juega un papel crucial en el control de la reorganización del citoesqueleto de actina, para formar los filopodios que llevan a la migración del tejido. Uno de los aspectos más desconocidos había sido la manera en la que el quemo-atrayente del tejido, Bnl, podía conducir a esta reorganización de la actina celular. Por ello, en este estudio se ha querido ahondar en el papel de la cascada de señalización de Btl/Bnl, poniendo especial énfasis en el papel del citoesqueleto de actina en la formación de este tejido. En vertebrados, la principal proteína de unión a actina encontrada en los filopodios es la Fascina. La Fascina pertenece a una familia de proteínas (llamadas Fascinas) también muy conservada evolutivamente, que organiza y empaqueta haces de actina. Esta proteína globular une fuertemente los filamentos de actina, de misma polaridad y colocados en paralelo, dándolos la estabilidad necesaria para formar diferentes tipos de protrusiones celulares. Muchas de estas protrusiones están principalmente relacionadas con la migración de varios tejidos y tipos celulares. De hecho en los últimos años la expresión anormalmente elevada de la fascina en adultos, se ha relacionado con varios carcinomas muy agresivos. Se cree que aquí, la Fascina podría jugar un papel crucial en la formación de los invadosomas, unas protrusiones esenciales para la invasión de otros tejidos. De ésta manera, la Fascina facilitaría el proceso metastático, principal razón de fallecimiento en pacientes de cáncer. En Drosophila tan sólo existe una proteína homóloga, llamada Singed (Sn) (nombre que se le dio porque las moscas mutantes para sn tienen sus quetas muy rizadas, como quemadas, significado de “singed”). Durante esta investigación, se han estudiado las funciones de Sn durante el desarrollo del sistema traqueal, desde el nivel tisular hasta el molecular, centrada en la migración traqueal y su relación con la cascada de señalización que la controla, Bnl/Btl. Debido a que muchas proteínas de unión a actina suelen actuar en cooperación, se estudiaron además posibles colaboradores de Sn. Esta investigación ha demostrado que sn se expresa en las células que lideran la migración del sistema traqueal durante su desarrollo (células de fusión y células teminales). Esta expresión está inducida por la cascada de señalización de Bnl/Btl a través de sus factores de transcripción positivo y negativo (Pointed y Anterior Open, respectivamente). Además, Sn es necesaria para varios procesos que tienen lugar en los dos tipos celulares cuyas propiedades migratorias, incluida la formación de filopodios, llevan a la migración del tejido. En concreto, se ha mostrado en este trabajo que Sn es importante para la fusión de las ramas traqueales, la especificación de las células terminales, la guiada formación del lumen en las células terminales, y la correcta forma de las células de fusión y terminal. Como se esperaba, Sn se requiere durante la migración del sistema traqueal, tanto para la velocidad como para la direccionalidad. Un estudio más profundo del papel molecular de la proteína evidencia que Sn es esencial para la formación de los filopodios (modificando su forma, estabilidad y número). Muy probablemente esto es debido a que Sn modifica el citoesqueleto de actina de las células traqueales. La falta de largos haces de actina en las células líder, cambiaría la reorganización de la actina del lamelipodio y filopodios, dando lugar a células muy irregulares que parecen extender y moverse con dificultad al sitio correcto. Mi hipótesis tras estos resultados y una extensa bibliografía es que los haces de actina y los filopodios traqueales son necesarios para la correcta señalización celular, la adhesión y la migración celular durante el desarrollo del sistema traqueal. Además este estudio ha demostrado que la fosforilación de Sn regula su función en los procesos anteriormente mencionados, como ya había sido demostrado en la formación de las quetas y ciertas neuronas, pero al contrario de lo publicado en plasmatocitos y células nodrizas. Por último, este trabajo ha relacionado por primera vez a la proteína de unión a actina llamada Forked (F) con la formación de una protrusión dinámica, como es el filopodio en las células traqueales. Aquí se ha probado que sn y f interaccionan genéticamente para el correcto desarrollo del sistema traqueal y que, de hecho, cooperan para la correcta formación de los filopodios. En resumen, este trabajo da por fin un nexo molecular entre la cascada de señalización de Bnl/Btl y el citoesqueleto de actina, y da una pista más sobre cómo las células son atraídas hacia sus quemo-atrayente para generar un tejido sano. Además, da nuevas pistas a los investigadores de oncología sobre la regulación del gen y cómo funciona a nivel molecular. Nuestros datos deberían permitir comprender mejor por qué razón las células cancerígenas aumentan la expresión de la fascina (y qué ventajas les proporciona a estas células), aumentando así las posibilidades de utilizar la Fascina como posible diana de terapias anticancerígenas. Esta investigación proporciona nueva información sobre la migración del sistema traqueal, la dinámica de las células que la lideran, y sobre el versátil papel que juega el citoesqueleto de actina en cada momento y tipo celular. Procesos celulares ya conocidos poseen ahora nuevos detalles moleculares.