In deep study of new tuberculosis vaccine candidates based on phoP and fadD26 mutations

El primer objetivo de este trabajo fue caracterizar las interacciones con el hospedador del nuevo candidato a vacuna viva atenuada contra la tuberculosis, MTBVAC. En este estudio se comparó la proteómica de la fracción secretada de MTBVAC y su cepa parental Mt103 a través de las técnicas de western-blot y electroforesis fluorescente diferencial en dos dimensiones (DiGE). Se obtuvieron dos conjuntos de datos de proteínas secretadas mayoritariamente por MTBVAC o Mt103 respectivamente. Gracias a estos resultados se observó el alto porcentaje de sustratos del sistema de secreción TAT (Twin Arginine Translocation) entre la fracción secretada por MTBVAC, y se pudo confirmar la ausencia de los factores de virulencia ESAT-6 y CFP-10 en dicho secretoma. El tráfico intracelular de MTBVAC fue otro aspecto a estudiar de la interacción del candidato a vacuna con su hospedador. MTBVAC es un mutante doble en los genes phoP y fadD26, por lo que se quiso estudiar también la contribución individual de cada mutación al fenotipo final. Se llevaron a cabo infecciones con las correspondientes cepas GFP+ en dos modelos celulares diferentes: la línea celular de macrófagos alveolares de ratón (MHS) y macrófagos primarios humanos derivados de monocitos (hMDM); los resultados se analizaron mediante técnicas de microscopía. Los resultados obtenidos sugieren que MTBVAC, como cepa atenuada que es, no es capaz de detener la maduración del fagosoma en etapas tempranas del proceso, sin embargo la detiene antes de llegar a la fase lisosomal. Mediante esta estrategia MTBVAC evita ser degradada rápidamente en el fagolisosoma. Sin embargo, debido a haber perdido la habilidad de secretar ESAT-6 y CFP-10, MTBVAC no es capaz de escapar al citosol de la célula hospedadora, presentando un fenotipo de persistencia en el cual MTBVAC está “atrapada” en un estadio endosomal tardío. Las mutaciones en los genes phoP y fadD26 de MTBVAC parecen tener un efecto sinérgico sobre el fenotipo del tráfico intracelular del candidato a vacuna. El segundo objetivo fue el estudio exhaustivo del regulon PhoP para tratar de determinar la señal que activa y modula su expresión. Para ello se utilizaron dos estrategias: i) estudiar la expresión de diferentes genes regulados por PhoP a través de un sistema reportero basado en fusiones genéticas de promotores de dichos genes con la proteína GFP, ii) medida directa de la expresión de varios genes regulados por PhoP a través de la extracción de RNA y la técnica de qRT-PCR. En ambos casos, la cepa parental H37Rv y su mutante phoP fueron expuestos a un ambiente intracelular, bien sometiéndolas a condiciones in vitro que trataban de mimetizar las condiciones intrafagosomales (pH ácido, iones, temperatura, hipoxia, etc.) o bien infectando con dichas cepas células fagocíticas y no fagocíticas. Se eligió el promotor de pks2 como reportero más representativo de la actividad del regulón PhoP, demostrando el importante rol que tiene el pH acido en la activación de dicho regulón. Ninguna de las condiciones probadas muestra una señal única que active el regulón PhoP, sugiriendo que es un proceso multifactorial que tiene lugar durante la entrada de la bacteria al interior del macrófago. Sin embargo, la respuesta del regulón tras la exposición a pH ácido demuestra que el pH es un factor clave en la inducción de los genes regulados por PhoP. Basándonos en los resultados obtenidos, se propone una dinámica de expresión de los genes regulados por PhoP dependiente del tiempo post-infección. Los primeros genes activados por PhoP son aquellos relacionados con el metabolismo lipídico y el estrés oxidativo, probablemente para proteger a la bacteria frente al ambiente hostil del interior del fagosoma. Tras 3-5 días, los genes relacionados con el sistema de secreción ESX-1 son activados y en consecuencia, la bacteria secretará ESAT-6 y CFP-10 induciendo con ello la ruptura del fagosoma y su escape al citosol. A partir de este punto, la actividad del RNA no codificante Mcr7 es altamente inducida por PhoP, lo cual conlleva la inhibición del sistema de secreción TAT y consecuentemente se ve restringida la secreción de los componentes del complejo Antígeno 85 con el objetivo de “esconderse” de la respuesta de la célula hospedadora ahora que la bacteria se encuentra en el citosol. Este mecanismo permite a las bacterias virulentas evadir el control inmunológico del hospedador y en el organismo. El tercer objetivo de la presente tesis fue construir una vacuna hiper atenuada basada en MTBVAC para ser usada en la población con riesgo de inmunosupresión, para la que BCG está contraindicada. Se introdujo una tercera mutación en el gen zmp1 (Rv0198c) de MTBVAC (vacuna viva atenuada con mutaciones en los genes phoP y fadD26) con la intención de hiper atenuar la cepa manteniendo su eficacia protectora frente a tuberculosis. Se usó una estrategia de doble recombinación para generar el triple mutante en los genes phoP, fadD26 y zmp1. Resultados preliminares muestran que el triple mutante no mejora la atenuación, la capacidad de generar respuesta inmunológica o la eficacia protectora de MTBVAC; estudios más exhaustivos en otros modelos animales (cobayas) son necesarios para llegar a alguna conclusión. REFERENCIAS 1. WHO, Global Tuberculosis Control: WHO report 2011. 2011. 2. Russell, D.G., Who puts the tubercle in tuberculosis? Nat Rev Microbiol, 2007. 5(1): p. 39-47. 3. Walters, S.B., et al., The Mycobacterium tuberculosis PhoPR two-component system regulates genes essential for virulence and complex lipid biosynthesis. Mol Microbiol, 2006. 60(2): p. 312-30. 4. 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