Desarrollo y aplicación de sistemas rápidos para la detección, indentificación y caracterización de levaduras alterantes de alimentos.

La importancia de las levaduras se conoce desde hace mucho tiempo y con el desarrollo de la industria, se utilizan no sólo para la elaboración de un gran número de productos fermentados (cerveza, vino, quesos y embutidos), sino también para la producción de antibióticos, vitaminas, enzimas, etc. Sin embargo, las levaduras tienen también un aspecto negativo, debido a su potencial como alterantes de alimentos, lo que implica pérdidas económicas importantes para las industrias. En el presente trabajo se abordan aspectos relacionados con la identificación y caracterización molecular de algunas de las especies típicamente alterantes, pertenecientes a los géneros Debaryomyces, Zygosaccharomyces, Dekkera, Pichia y Saccharomyces. El objetivo es proporcionar a las industrias sistemas nuevos de identificación rápida de levaduras así como mostrar, con ejemplos concretos, la utilidad de la aplicación de las técnicas moleculares para resolver problemas a nivel industrial. Así, se ha determinado que la comparación de secuencias de la región ribosómica 5,8S-ITS y del gen de la actina resulta el método más óptimo para identificar de forma rápida y precisa las especies del género Debaryomyces, que están implicadas en la alteración de alimentos procesados. Además, el presente trabajo muestra cómo la aplicación de técnicas moleculares es de gran utilidad para determinar las levaduras alterantes a lo largo de la cadena de producción alimentaria. En el presente trabajo, se muestran dos ejemplos de contaminación en la industria, en concreto en la producción de turrón de frutas confitadas y en la elaboración de vino. Mediante las técnicas de RFLPs del mtDNA y RAPD-PCR se identificó la especie Zygosaccharomyces bailii como la levadura responsable de la alteración de dichos turrones, siendo los jarabes usados para macerar las frutas el origen de contaminación en la cadena de producción. Además, la caracterización fisiológica de dichas cepas, permitió evidenciar el potencial alterante de estas levaduras, ya que presentan una elevada resistencia a conservantes alimentarios, adaptación a bajo pH y baja aw. Por otro lado, la utilización de medios selectivos, como el DBDM, así como la técnica de análisis de restricción de la región 5,8S-ITS, permitieron identificar las especies Dekkera bruxellensis y Pichia guilliermondii como las levaduras alterantes más peligrosas en el vino, por su gran capacidad para producir elevados niveles de 4-etilfenol, responsables de olores desagradables en el vino. Mediante las técnicas de RFLPs mtDNA con HinfI y RAPD-PCR se determinó que el origen de contaminación de D. bruxellensis se produce antes del envejecimiento en barrica, y que las levaduras de la especie P. guilliermondii están presentes en las uvas y raspones, por lo que proceden del exterior de la bodega. Finalmente, y dado que la determinación del número de levaduras resulta esencial para los programas de conservación de alimentos, se consideró de gran interés desarrollar una técnica que permitiera la identificación y simultánea cuantificación de levaduras directamente en el alimento. En el presente trabajo, se ha desarrollado un protocolo de PCR a tiempo real específico para S. cerevisiae utilizando SYBR-Green como agente fluorescente. Dicha técnica resultó ser muy sensible, permitiendo la detección de 3-5 UFC/mL en vino. El sistema de PCR a tiempo real desarrollado es también útil para cuantificar de forma precisa el número de células de S. cerevisiae presentes en el vino, permitiendo de esta manera estimar el riesgo de alteración del vino durante su almacenamiento y distribución. Además, el sistema se puede extender a otros alimentos y bebidas donde S. cerevisiae puede causar alteración. __________________________________________________________________________________________________

Yeasts have been shown to be involved in the spoilage of an extensive range of foods, causing enormous economic losses. Consequently, a rapid and accurate identification of common spoilage yeasts is essential to detect and prevent food spoilage. In the present study, we assessed the identification of the Debaryomyces species. We found that these species can be identified both quickly and correctly by direct sequence comparison of the ribosomal 5.8S-ITS region and Actin gene. Moreover, the present work have shown two examples of the usefulness of the molecular monitoring of spoilage yeasts to solve contamination problems in the industry, specifically in the production of candied fruit nougats and in winemaking. Using RFLPs of mtDNA and RAPD-PCR for strain characterization, we determine that a strain of Zygosaccharomyces bailii was the responsible of the nougats alteration. Furthermore, physiological characterization showed that this isolate displayed a particular resistance to weak-acid preservatives, extreme osmotolerance, ability to adapt to high glucose concentrations, ability to vigorously ferment glucose and growth at low pH. Therefore, this strain can be considerate as significant spoiler of sugary products. By other hand, we studied those yeasts wich are responsible of spoilage in wine. We conclude that D. bruxellensis and P. guilliermondii are capable to produce high amounts of 4- ethylphenol and, consequently, off flavors in wine. Using RFLPs of mtDNA with HinfI and RAPD-PCR we could determine that D. bruxellensis strains are present in the wine before the aging in the barriques, so the contamination is not originating from the barrique wood. Moreover, the origin of P.guilliermondii is the vineyard, and the insects are vectors for its propagation within the winery. Finally, in order to provide winemakers with a rapid method to detect and prevent wine spoilage caused by Saccharomyces cerevisiae, we have developed a real-time PCR protocol. The method is very sensitive, and it is useful to estimate between 3.8 and 5 CFU/ml of S. cerevisiae directly in sweet and red wines respectively. Real-time PCR designed is useful to accurately quantify S. cerevisiae cells present in wine, and it could be adapted to other kinds of food where S. cerevisiae could cause spoilage.