Mecanismos celulares y moleculares implicados en los cambios comportamentales inducidos durante la dependencia de morfina= Cellular and molecular mechanisms involved in morphine dependence-induced behavioral alterations /

El objetivo del presente trabajo de investigación fue evaluar la metabolización de DA y NA en el NAc y los lugares específicos de fosforilación de la TH en el NAc, VTA, y NTS en ratones condicionados mediante preferencia de plaza a morfina; estudiar el papel del CRF1-R en los efectos reforzadores positivos de la morfina usando el paradigma de CPP; y examinar el impacto de la administración de morfina crónica y la abstinencia a la misma, en la expresión génica y la actividad en las neuronas orexinérgicas del LH, así como el papel de este neurotransmisor en el sistema cerebral del estrés durante el síndrome de abstinencia a opioides. La fosforilación de TH se determinó en ratones Swiss machos, mediante su cuantificación por western blot e inmunocitoquímica usando anticuerpos específicos para los estados de fosforilación enzimáticos; y los turnover de NA y DA fueron evaluados por HPLC. Un set de animales diferente fue pretratado con un antagonista del CRF1-R (CP-154,526) o con vehículo durante 6 días, seguidos de un test al CPP a morfina. Treinta minutos tras recibir el pretratamiento, los ratones recibieron una dosis de morfina los mismos días que recibían CP-154,526, o salino los mismos días que recibían vehículo, y eran condicionados inmediatamente después. Los animales control siempre recibieron vehículo y salino durante el protocolo. c-Fos y Ox-A, los turnover de DA y NA, y la concentración plasmática fueron evaluados por inmunocitoquímica, HPLC y RIA, respectivamente. Y por último, se indujo la dependencia a opioides en ratas macho Wistar con la administración crónica de morfina seguida por la administración de naloxona para inducir el síndrome de abstinencia. Los antagonistas selectivos de los OxR1 y OxR2, SB334867 y TCSOX229 respectivamente, se usaron para determinar si la actividad orexinérgica está relacionada con los signos somáticos de la abstinencia a opioides y las alteraciones generadas en el eje HHA y en la amígdala extendida durante la dependencia a morfina. De todos estos experimentos se obtuvieron tres bloques de datos: a) el CPP inducido por morfina fosforila la TH en la Ser40 en el NAc, lo que está asociado al incremento de la metabolización tanto de DA como de NA en dicho núcleo. También se observó que el CPP inducido por morfina incrementa los niveles de la TH fosforilada tanto en la Ser40 como en la Ser31 en el NTS. b) al antagonizar el CRF1-R, se bloqueó el CPP inducido por morfina y se incrementó del turnover de NA en el NAc en los ratones que recibieron morfina. Aunque el CP-154,526 antagonizó el incremento de la expresión de c-Fos generada por el CPP a morfina en el VTA y NAc, éste no indujo ningún efecto en el turnover de DA en el NAc. El antagonista de CRF1-R, también bloqueó la activación de las neuronas orexinérgicas en el LLH. c) Durante la abstinencia a morfina, se induce una activación de neuronas Ox-A en el LH. Por otra parte, se observó cómo ambos antagonistas de los OxR atenuaron los signos somáticos del síndrome de abstinencia a morfina, y cómo la administración del SB-334867 redujo la expresión de c-Fos en el NAc, BNST, CeA y PVN previamente inducida por dicho síndrome; aunque la administración de TCSOX229 indujo una hiperactivación en el PVN. La administración de ambos antagonistas orexinérgicos no generó ninguna modificación en la actividad del eje HHA. Recopilando los datos previamente expuestos, se demuestra: 1. que el CPP inducido a morfina estimula la actividad de la TH y acelera la metabolización de DA y NA en el NAc, a través de un mecanismo de fosforilación de dicha enzima. 2. que el CPP inducido a morfina activa diferentes áreas cerebrales implicadas en los mecanismos de recompensa, destacando un papel crítico del CRF1-R en dicha activación, así como en cambios moleculares implicados en el comportamiento inducido por la administración de morfina. 3. el síndrome de abstinencia a morfina, inducido por la administración de naloxona, activa las neuronas orexinérgicas de las tres subdivisiones del LH, acompañado por un aumento en la transmisión orexinérgica al sistema cerebral del estrés. 4. estos datos revelan el papel crítico que juega el sistema de orexinas en los síntomas físicos que ponen de manifiesto el síndrome de abstinencia a opioides. CELLULAR AND MOLECULAR MECHANISMS INVOLVED IN MORPHINE DEPENDENCE-INDUCED BEHAVIORAL ALTERATIONS The purpose of the present research was to evaluate the turnover of DA and NA in the NAc and the site-specific phosphorylation of TH in the NAc, VTA, and NTS on the morphine CPP mice; to study the role of CRF1-R in the positive reinforcement effects of morphine using the CPP paradigm; and to examine the impact of chronic morphine and withdrawal on the lateral hypothalamic (LH) orexin A (Ox-A) gene expression and activity, as well as Ox-A involvement in the brain stress response to morphine abstinence. TH phosphorylation was determined in male Swiss mice by quantitative blot inmunolabeling and immunohistochemistry using phosphorylation state-specific antibodies; NA and DA turnover was evaluated by high performance liquid chromatography. A different set of animals were treated with a CRF1-R antagonist (CP-154,526) or vehicle during 6 days. Thirty min after receiving the antagonist, mice were injected with morphine on the same days that CP-154,526 was administered, or saline on the same days that vehicle was administered, and were immediately conditioned. Control animals received antagonist or vehicle, and saline every day. On day 7, animals were tested for morphine-induced CPP. c-Fos and Ox-A, DA and NA turnovers, and corticosterone plasma concentration were evaluated by immunohistochemistry, HPLC and RIA, respectively. And at last, male Wistar rats received chronic morphine followed by naloxone to precipitate withdrawal. The selective OxR1 antagonist, SB-334867, was used to examine whether orexins’ activity is related to somatic symptoms of opiate withdrawal and alterations in HPA axis and extended amygdala in rats dependent on morphine. All these experiments resulted in three different sets of data: a) Morphine-induced CPP phosphorylates TH at serine (Ser)40 in NAc, which is associated with an enhanced of DA and NA turnover. We also found that morphine-induced CPP increased levels of TH phosphorylated at Ser31 and Ser40 in the NTS. b) CRF1-R antagonism blocked the morphine-induced CPP and the increased NA turnover in the NAc in morphine-paired mice. Although CP-154,526 antagonizes the enhancement in c-Fos expression evoked by morphine-induced CPP in the VTA and NAc, CP-154,526 had no effect in the augmented DOPAC/DA ratio in the NAc. CRF1-R antagonist blocked the activation of the orexinergic neurons in the LLH. c) During morphine withdrawal, there was an activation of Ox-A neurons in the LH. Importantly, SB-334867 attenuated the somatic symptoms of withdrawal, and reduced morphine withdrawal-induced c-Fos expression in the NAc shell, BNST, CeA and hypothalamic PVN, but did not modify the HPA axis activity. The conclusions of the present study demonstrate: 1. that morphine-induced CPP might stimulate TH activity and accelerate DA and NA turnover in the NAc via a mechanism involving phosphorylation of TH. 2. that morphine-induced CPP activates different brain areas involved in reward, and points out a critical role of CRF1-R, in molecular changes involved in morphine-conducted behaviours. Thus, our study supports a therapeutic potential of CRF1-R antagonists in addictive disorders. 3. a critical role of Ox-A signalling, via OxR1, in activation of brain stress system to morphine withdrawal and suggest that all orexinergic subpopulations in the lateral hypothalamic area contribute in this response.